炎琥寧對(duì)COPD大鼠肺組織IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號(hào)通路影響探討

肖祖克 ，孫 慧 ，葉 東 ，李 星

(1、江西省人民醫(yī)院呼吸科，南昌 330006；2、江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006；3、江西省永修縣人民醫(yī)院，永修 330300)

越來(lái)越多的證據(jù)表明，IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號(hào)通路在CS引起的肺部炎癥中起著重要的作用[1]。本次研究中，以炎琥寧對(duì)COPD大鼠肺組織IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號(hào)通路影響進(jìn)行研究分析為目的，建立了COPD大鼠模型，并對(duì)正常對(duì)照組、COPD大鼠組、COPD炎琥寧注射液組大鼠血清以及肺泡灌洗液中的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠，體重在180-220g，級(jí)別為SPF。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。脂多糖購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)為L(zhǎng)2880；椰樹(shù)牌香煙，焦油量為11mg，氯化鈉注射液，購(gòu)自貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)為B160623I；變色硅膠，購(gòu)自青島裕睿化工有限公司，批號(hào)為160802；苦味酸為分析純，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)為160403；水合氯醛購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20160305；瑞姬氏染色試劑盒，購(gòu)自西化儀（北京）科技有限公司，型號(hào)為81/M322967；磷酸鹽緩沖液，購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，批號(hào)為NXH0696；自制煙熏箱（亞克力材質(zhì)）；電子天平購(gòu)自深圳市華恒科技有限公司，分析天平購(gòu)自香港佳立國(guó)際有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 取大鼠（8周齡，雄性）60只，分為正常組、COPD造模組、COPD造模注射炎琥寧組，每組20只。分組后對(duì)各組大鼠進(jìn)行標(biāo)記并編號(hào)，分組標(biāo)記后給予各組大鼠同樣的飼料及飲用水。

1.2.2 給藥方法 造模2個(gè)月后，開(kāi)始給予各組分別進(jìn)行藥物治療，共持續(xù)28d。正常對(duì)照組：10ml/kg注射用生理鹽水，腹腔注射，每天1次；COPD組：10ml/kg注射用生理鹽水，腹腔注射，每天1次；炎琥寧組：炎琥寧36mg/kg，腹腔注射，每天1次。

1.2.3 取材 肺泡灌洗液的采集：腹主動(dòng)脈采血后，剪開(kāi)大鼠的頸部皮膚，暴露頸部器官，打開(kāi)胸腔，剝離覆蓋肺組織的胸腺和心包，然后找到氣管分支，結(jié)扎右主支氣管，用0.9%的無(wú)菌生理鹽水6ml，經(jīng)氣管注入左主支氣管及左肺，反復(fù)慢慢回抽4次，回抽液大約 4-5ml，回收率 70%-80%，于 4℃，3000r/min 下離心10min，吸取上清液，置于2ml冷凍管中，-80℃超低溫冰箱保存。肺泡灌洗液離心后所得的細(xì)胞沉淀用1ml滅菌的PBS重懸后，保存于2ml冷凍管中，4℃冰箱中保存，用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)計(jì)數(shù)。肺組織固定方法：結(jié)扎左肺，松開(kāi)右肺，經(jīng)氣管注入4%的多聚甲酸溶液5ml，固定30s，取出右肺中葉，于4%的多聚甲酸中保存，用于HE染色。

1.2.4 檢測(cè)方法 冰箱中取出大鼠血清、BALF上清液，放至室溫，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行大鼠血清和 BALF 中 IFN-γ，IL-12，IL-12R，IL-4，IL-4R水平檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采取SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料經(jīng)（x±s）形式表示，統(tǒng)計(jì)分析采取t檢查，計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)分析采取χ2檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)，視為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

COPD大鼠組IL-4R、IL-4水平較正常對(duì)照組發(fā)生顯著降低 （P＜0.05），IFN-γ、IL-12、IL-12R 水平較正常對(duì)照組發(fā)生明顯升高（P＜0.05）；COPD炎琥寧注射液組大鼠血清和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12、IL-12R水平較COPD大鼠組發(fā)生明顯降低（P＜0.05），IL-4、IL-4R 水平較 COPD 大鼠組發(fā)生明顯升高（P＜0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠血清以及肺泡灌洗液中IFN-γ檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

STAT是一種新型的轉(zhuǎn)錄因子家族，主要負(fù)責(zé)連接胞外細(xì)胞因子與Th分化轉(zhuǎn)錄因子之間的胞內(nèi)信號(hào)傳遞[2]。在Th0細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的過(guò)程中，一種細(xì)胞因子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中對(duì)STAT分子的選擇具有一定特異性，IL-4激活STAT6誘導(dǎo)Th2分化，IL-12激活STAT4誘導(dǎo) Th1分化[3]。STAT4是決定Th1細(xì)胞因子作用的關(guān)鍵信號(hào)因子，其信號(hào)途徑由IL-12激活，可以誘導(dǎo)Th1效應(yīng)因子IFN-γ的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。STAT6信號(hào)途徑依賴(lài)IL-4誘導(dǎo)，其在Th2細(xì)胞基因表達(dá)及發(fā)育上發(fā)揮重大作用。因此可見(jiàn)，通過(guò)IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號(hào)通路活化和誘導(dǎo)的Th1、Th2細(xì)胞分化，可直接影響COPD氣道炎癥及病理改變的發(fā)生發(fā)展[4]。

炎琥寧系穿心連提取物經(jīng)酯化、脫水、成鹽精制而成，具有抗炎、滅菌的作用。本實(shí)驗(yàn)我們假設(shè)，炎琥寧IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號(hào)通路對(duì)抗CS對(duì)COPD大鼠肺部的免疫失衡，從而對(duì)延緩肺泡上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，達(dá)到保護(hù)肺部的作用[5]。

本研究通過(guò)建立COPD大鼠模型，設(shè)置正常組、COPD大鼠組及炎琥寧注射液COPD大鼠組，檢測(cè)各組大鼠血清、肺泡灌洗液中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12、IL-12R、IL-4、IL-4R 水平，并提取大鼠肺組織， 檢測(cè)STAT4、STAT6蛋白水平，及STAT4mRNA、STAT6mRNA的表達(dá)情況[6]。實(shí)驗(yàn)研究顯示， 各組大鼠在 IFN-γ、IL-12、IL-12R、IL-4、IL-4R、STAT4、STAT6蛋白水平存在差異，由此證實(shí)，炎琥寧可通過(guò)IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號(hào)通路影響COPD疾病進(jìn)展。

表2 各組大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-12、IL-12R檢測(cè)結(jié)果比較

表2 各組大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-12、IL-12R檢測(cè)結(jié)果比較

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表3 各組大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4、IL-4R檢測(cè)結(jié)果比較（

表3 各組大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4、IL-4R檢測(cè)結(jié)果比較（

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