羥基紅花黃色素A對高脂血癥脂肪肝大鼠肝臟功能的干預作用＊

柴 文，付龍生，呂燕妮

(1、江西省人民醫院神經內科，南昌 330006；2、南昌大學第一附屬醫院藥學部，南昌 330006)

2016年《中國成人血脂異常防治指南》報道[1]，中國成人血脂異常總體患病率高達40%，以低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）或血清總膽固醇（TC）升高為特點的血脂異常是動脈粥樣硬化性心血管疾病的主要原因，血脂異常將導致2010年-2030年期間我國心血管病事件約增加920萬，而肝臟是合成內源性膽固醇和脂質代謝的重要器官，血脂異常也容易造成肝臟的負擔和功能異常。目前臨床常用改善血脂異常的藥物包括他汀類、煙酸類、貝特類等，但長期大劑量服用可能有潛在的肝臟功能損害等副作用。而以中醫藥理論為基礎的中藥活性成分，在高脂血癥的治療中具有其獨特的優勢。在2017年《紅花黃色素臨床應用中國專家共識》中明確HSYA具有調脂作用[2]，機制研究也提示HSYA可通過促進小鼠3T3-LI前脂肪細胞激素敏感脂肪增殖分化、減少前脂肪細胞數量、增強抗氧化能力達到降低血脂目的[3]。本試驗以高脂血癥脂肪肝大鼠為模型，通過給予不同劑量的HSYA，闡述HSYA對高脂血癥脂肪肝大鼠肝臟功能的影響及其作用機制，為HSYA作為一種降脂護肝有效成分在中藥的轉化與轉歸中提供科學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 羥基紅花黃色素A購自江蘇澤朗生物科技有限公司，純度＞98%。膽固醇（中國醫藥集團上海化學試劑公司，AR級，批號F20030410），脫氧膽酸鈉（北京雙旋微生物培養基制品廠，批號20030617），丙硫氧嘧啶片（上海復星朝暉藥業有限公司，批號030505），吐溫80（蚌埠化學試劑廠，符合藥用標準，批號20030602），1-2丙二醇 （淮南市化學試劑廠，AR級，批號20021020），豬油自制。天冬氨酸轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、天冬氨酸轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、 丙 二 醛 （Malondialdehyde，MDA)，過氧化氫酶（HydrogenPeroxidase，CAT）測試盒和油紅O染液均購自南京建成生物工程研究所。阿托伐他汀鈣片（規格：20mg，商品名：立普妥，批號2EZPA16001)購自輝瑞公司。雄性Spague-Daw lay SD 大鼠，清潔級，體重 180～200g，72 只，合格證號SCXK（20080033浙），由揚州大學比較醫學中心提供。

1.2 實驗動物分組及處理 72只SD大鼠隨機分為6組，每組12只。設正常對照組、高脂血癥脂肪肝模型組、HSYA 低、中、高劑量組（2、4、8mg/kg）、阿托伐他汀鈣片組（3mg/kg）。除正常對照組外，其余各組動物均給予脂肪乳劑，脂肪乳劑制備方法按照文獻[3]報道。高脂血癥脂肪肝模型，給予每天10ml/kg灌胃，連續2周，阿托伐他汀鈣片組及HSYA低、中、高劑量組，各給藥組灌胃給予相應的藥物，同樣連續給藥2周。同時正常對照組、高脂血癥脂肪肝模型組灌胃給予同等體積的生理鹽水。實驗之前，禁食禁水12h，處死灌洗后迅速取肝臟組織，并在-70℃冰箱保存，測定肝臟組織中AST、ALT、SOD、MDA 和 CAT 水平，觀察肝臟形態和western blot實驗。

1.3 觀察指標測定 大鼠新鮮肝臟組織經生理鹽水簡單灌洗后，加入組織裂解液在冰水中制成勻漿，4℃ 4，000r/min 離心 10min，提取上清液，肝臟生化指標均按試劑盒規范操作測定。

1.4 肝臟形態學檢測 用于肝臟形態學觀察的大鼠，每組取6只大鼠，使用100g/L水合氯醛深麻醉下處死，取肝臟組織，并生理鹽水簡單灌洗，直到灌洗液無明顯紅色為止，再用40g/L多聚甲醛灌注，直至流出液體為淡紅色或透明色。切下的肝臟小塊在4℃40g/L多聚甲醛溶液中固定24h后，脫水進行石蠟包埋，切片5μm，常規HE染色。或經處理的肝臟切片，用60%異丙醇漂洗約30s，充分甩干約20s，用60%油紅O上層液染片約5-10s漂洗掉多余染液，甘油明膠固定封片，光學顯微鏡下觀察肝臟形態，考察各組肝脂肪變性程度。

1.5 Western blot法檢測肝臟相關蛋白水平 將取得的大鼠肝臟加細胞裂解液勻漿離心后取蛋白，BCA定量蛋白劑量40μg上樣，采用10%的SDSPAGE分離蛋白，轉印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2h后，加1：1000稀釋大鼠抗高脂血癥組固醇調節元件結合蛋白-2（Sterol-regulatory elementbinding protein，SREBP-2）SREBP-2 抗體、 大鼠抗LDL（LDL receptor，LDL-R）LDL-R 抗體、大鼠抗羥甲基戊二酰輔酶A還原酶 （3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR）HMGCR 抗體、大鼠抗脂肪酸合成酶 （Fatty acid synthetase，FAS）FAS抗體和大鼠抗β-actin抗體，4℃過夜。漂洗后加辣根過氧化物酶標記的兔抗大鼠動物抗體（1：1000）， 室溫孵育 50min，ECL 法顯色，Bio-Rad公司生物圖像分析系統捕獲。

1.6 統計學處理 所有數據采用（mean±SD）表示，對于兩組間的比較用Students’t檢驗，當3組或3組以上比較時用單因素方差分析，后檢驗采用Students’t，P＜0.05 認為有統計學意義。

2 結果

2.1 對肝功能指標的影響 與正常對照組比較，高脂血癥脂肪肝組肝臟中AST、ALT和MDA顯著升高，SOD、CAT明顯下降，有統計學差異，提示造模成功。各劑量HSYA給藥組均能顯著降低肝臟中AST、ALT和MDA水平，并同時升高SOD、CAT水平，且呈劑量依賴性，提示HSYA對高脂血癥損傷肝功能的生化指標有改善作用。

2.2 對肝臟病理組織的比較 正常對照組大鼠肝細胞排列規則，肝細胞呈多邊形，胞漿均勻，細胞核形態正常。與正常對照組比較，高脂血癥組脂肪肝組出現不同程度的脂肪變性和空泡樣變及纖維化明顯，變性的肝細胞多為圓形，體積增大，肝細胞形態改變。給予HSYA后，高脂血癥脂肪肝組脂肪變性程度及細胞腫脹減輕，空泡變少，肝細胞的體積大小有所恢復，且呈劑量依賴性。

2.3 對肝臟病理組織脂滴形成的比較 正常對照組肝細胞結構完整，未見紅色脂滴，高脂血癥脂肪肝模型組，肝細胞可見大小不等的紅色脂滴，給予HSYA后，高脂血癥脂肪肝組肝細胞內紅色脂滴觀察到均有不同程度地減少，改變呈劑量依賴性。

2.4 對肝臟相關蛋白表達 高脂血癥脂肪肝組大鼠肝臟SREBP-2、LDL-R、HMGCR和FAS表達與正常對照組比較表達降低。與高脂血癥脂肪肝組比較，給予 HSYA干預后，SREBP-2、LDL-R，HMGCR和FAS蛋白顯著升高，且低中劑量HSYA對大鼠肝臟SREBP-2、LDL-R，HMGCR和FAS蛋白升高的效果更佳明顯。

表1 HSYA對高脂血癥脂肪肝大鼠肝臟AST、ALT、SOD、MDA和CAT的影響

表1 HSYA對高脂血癥脂肪肝大鼠肝臟AST、ALT、SOD、MDA和CAT的影響

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

?

表2HSYA干預后高脂血癥脂肪肝大鼠肝臟中相關蛋白的表達

3 討論

《藥品化義》中認為紅花善通利經脈，為血中氣藥，現代分析技術表明HSYA是紅花藥理功效的最有效水溶性部位的主要有效成分。本研究中所用的高脂血癥脂肪肝模型[4]，是基于高脂血癥致脂肪肝病變的一種，在發生高脂血癥后，由于肝細胞轉運膽固醇能力下降、或相應LDL受體減少等機制而產生，此模型可代表血脂高后的肝臟功能異常，在研究血脂相關疾病方面具有代表性。本實驗研究結果表明，HSYA對高脂血癥肝臟形態及功能指標有改善作用，提示HSYA有調節血脂、膽固醇代謝和保護肝臟的作用。靳宏光等[5]報道，羥基紅花黃色素A可降低高脂飼料喂養的兔模型中血清TC、LDL-C及MDA，減少頸動脈粥樣硬化斑塊數量和面積，通過降低血脂和增強抗氧化作用以治療動脈粥樣硬化。王藝蓉等[6]報道在四氯化碳誘導肝纖維化大鼠中，HSYA對肝組織中轉化生長因子-β1有抑制作用，可減輕水腫程度，抑制纖維化，促進肝損傷修復。并且在本實驗有效劑量上，HSYA對肝功能損傷在50、100、150mg/kg間出現明顯的劑量-效應關系，相對于阿托伐他汀鈣片，具有起效早、作用穩定、強效的特點，可有效對血脂脂肪肝進行調節。

臨床常規檢驗提供的血脂參數包括TC、HDLC、LDL-C、VLDL-C與TG。流行病學與觀察性研究發現，LDL-C水平與ASCVD的發病風險密切相關，LDL是致動脈粥樣硬化病變的基本因素。基礎研究發現，LDL通過血管內皮進人血管壁內，在內皮下滯留的LDL被修飾成氧化型LDL，繼而被巨噬細胞吞噬后形成泡沫細胞，不斷增多融合的泡沫細胞，構成動脈粥樣硬化斑塊的脂質核心[7，8]。另外HDL-C與TG水平與ASCVD的發病也存在相關性[9]，HDL-C水平降低和或TG水平增高的人群中，專家仍建議以LDL-C為干預血脂異常的主要靶點，力爭將HDL-C和TG控制于理想范圍（HDL-C≥1.04mmol/L，TG＜1.7mmol/L）。 目前臨床常用的調節血脂藥物，他汀類藥物[10]可有效降低LDL-C，但升高HDL-C作用有限，僅能升高5%-15%。貝特類和煙酸類藥物升高HDL-C作用強于他汀類藥物，可使HDL-C升高10%-35%[11]，本實驗研究結果表明HSYA不僅具有降低TC、LDL-C與TG的作用，還具有升HDL-C的作用，有很好的應用價值。

高脂血癥肝臟的病理結果顯示，當血脂及膽固醇含量增加時，SREBP-2、LDL-R、HMGCR、FAS相關蛋白表達量增高，從形態學上可見加重肝臟的病理變化。固醇調節元件結合蛋白 （sterolregulatory element-binding proteins，SREBPs） 是脂質代謝的重要轉錄因子，包括兩種異構體SREBP-1和SREBP-2，可調控脂肪酸和膽固醇的合成[12]，其中有報道SREBP-2可直接影響細胞膜上TC代謝水平，作為一種特異的核轉錄因子主要參與TC合成酶的基因調控，在TC含量降低的情況下，增進HMG-CoA還原酶、LDL受體等靶基因的表達，從而升高細胞內TC水平[13]。LDL-R位于肝臟表面，其能夠與多種結構及功能各異的配體相互作用，對血脂的動態平衡及纖溶功能的穩定進行調節，介導血漿中LDL-C的含量、調節血漿含量和體內TC的水平[14]。HMG-CoA還原酶在HMG-CoA的催化作用下，經過一系列催化、轉化作用能夠抑制肝內膽固醇合成速度，減少或阻斷體內膽固醇合成，從而對高脂血癥進行治療，現在臨床所用的他汀類藥物如阿托伐他汀鈣片、氟伐他汀片、辛伐他汀片均為HMG-CoA還原酶抑制劑藥物，已成為治療高脂血癥的主要藥物。脂肪酸合酶FAS是肝臟脂代謝關鍵因子，參與調節脂肪酸合成酶的合成[15]，減少FAS的合成對減少脂肪酸的合成有重要作用。以上4種蛋白均參與血脂和膽固醇調節，而其中SREBP-2可作用調控和影響LDL-R，HMGCR和FAS基因的轉錄因子，誘導下游脂質異常的發生和發展。

血脂的調節機制涵括減少外源性吸收、抑制內源性合成和促進內源性轉化等多個方面，目前關于HSYA調節血脂的機制研究相對局限，本研究針對其抑制內源性合成和肝臟保護方面進行研究，然而其更豐富的機制仍需探索。本研究通過構建高脂血癥脂肪肝大鼠模型，從肝臟功能指標通路探討高脂血癥脂肪肝大鼠肝功能異常特點，同時表明HSYA可抑制血清血脂指標異常，并對肝臟功能具有保護作用，更深入的機制研究仍有待于進一步探索。

[1]中國成人血脂異常防治指南修訂聯合委員會.中國成人血脂異常防治指南 （2016年修訂版）[J].中國循環雜志，2016，31（10）：937-952.

[2]《紅花黃色素臨床應用中國專家共識》編寫組.紅花黃色素臨床應用中國專家共識 [J].中國中西醫結合雜志，2017，3（10）：1167-1173.

[3]唐紅，魯道旺，楊詹詹，等.羥基紅花黃色素A的藥理學研究進展[J].廣州化工，2017，45（14）：20-22.

[4]倪鴻昌，李俊，金涌，等.大鼠實驗性高脂血癥和高脂血癥性脂肪肝模型研究[J].中國藥理學通報，2004，20（6）：703-706.

[5]靳宏光，姜琛，田宇丹.羥基紅花黃色素A對兔動脈粥樣硬化影響的實驗研究[J].上海中醫藥雜志，2011，45（4）：67-68.

[6]王藝蓉，白咸勇，李京敏，等.羥基紅花黃色素A對肝纖維化大鼠肝組織 TGF-β1 表達的影響 [J].濱州醫學院學報，201，3（6）：405-408.

[7]劉勇華，劉丹.OATP遺傳多態對口服降糖藥及調血脂藥轉運的影響及可能的相互作用機制研究 [J].江西醫藥，2017，52（6）：576-578，589.

[8]Watanabe K，Watanabe R，Konii H，et al.Counteractive effects of omentin-1 against atherogenesis[J].Cardiovasc Res，2016，110（1）：118-128.

[9]韓飚，夏芝輝，閆智杰，等.監測血漿高密度脂蛋白對老年重癥肺部感染患者的預測價值[J].江西醫藥，2017，52（7）：617-619.

[10]Nicholls SJ，Ray KK，Ballantyne CM，et al.Comparative effects of cholesteryl ester transfer protein inhibition，statin or ezetimibe on lipid factors：the Accentuate trial[J].Atherosclerosis，2017，261：12-18.

[11]ITO MK.Long-chain omega-3 fatty acids，fibrates and niacin as therapeutic options in the treatment of hypertriglyceridemia：a review of the literature[J].Atherosclerosis，2015，242（2）：647-656.

[12]Vergnes L，Chin RG，DE Aguiar Vallim T，et al.SREBP-2-deficient and hypomorphic mice reveal roles for SREBP-2 in embryonic development and SREBP-1c expression[J].J Lipid Res，2016，57（3）：410-421.

[13]Kandasamy N，Ashokkumar N.Renoprotective effect of myricetin restrains dyslipidemia and renal mesangial cell proliferation by the suppression of sterol regulatory element binding proteins in an experimental model of diabetic nephropathy[J].Eur J Pharmacol，2014，743：53-62.

[14]Ngosock ET，Chapados NA，Lavoie JM.LDL receptor and Pcsk9 transcripts are decreased in liver of ovariectomized rats：effects of exercise training[J].Horm Metab Res，2014，46（8）：550-555.

[15]Bruce KD，Zsombok A，ECKEL RH.Lipid Processing in the Brain：A Key Regulator of Systemic Metabolism[J].Front Endocrinol(Lausanne)，2017，8：60.