SURVIVIN在無精子癥患者睪丸組織中的表達研究＊

黎衍敏，鄧小林，楊 軍

(1、江西省贛南醫學院第一附屬醫院泌尿外科，贛州 341000；2、江西省贛州市人民醫院泌尿外科，贛州 341000)

SURVIVIN是近些年新發現的一種凋亡抑制蛋白，也是迄今為止被發現的最強的凋亡抑制蛋白之一，其可有效抑制細胞凋亡并能促進細胞分裂[1]，相關研究表明：SURVIVIN在人類惡性組織中尤其是各類惡性腫瘤中高表達，而在正常分化的組織中卻很少有表達[2]。雖然目前關于SURVIVIN在男性無精子癥患者睪丸組織中的表達方面的研究較少，但許多資料表明，SURVIVIN與精子的生成有一定相關性[3，4]。本文旨在通過研究SURVIVIN在無精子癥患者睪丸組織中的表達情況，初步探討SURVIVIN與精子生成的關系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性收集我院2015年2月-2016年11月期間收治的40例無精子癥患者為研究對象。其中梗阻性無精子癥患者其生精功能正常，共 10 例，年齡 24-42 歲，平均（28.24±1.82）歲。非梗阻性患者30例，依據患者睪丸穿刺活檢病理結果分為：生精功能低下患者10例，年齡24-40歲，平均年齡（23.43±2.12）歲；生精功能阻滯患者10 例，年齡 25-39 歲，平均年齡（29.32±1.85）歲；唯支持細胞綜合癥患者10例，年齡23-41歲，平均年齡（23.43±1.67）歲。研究開始前已征得患者同意，患者均已簽署《知情同意書》；本次研究已通過本院醫學倫理委員會審查，研究符合醫學倫理標準。

1.2 方法 使用購自上海通蔚生物科技有限公司的兔抗人SURVIVIN多克隆抗體；使用購自上海拜力生物科技有限公司的免疫組化試劑盒；選用購自南京邁博生物科技有限公司的DAB顯色試劑盒。選用免疫組化二步法對已備切片行SURVIVIN檢測[5]。具體操作如下：以4μm厚度為準，對石蠟標本連續切片，按照常規方法行二甲苯脫蠟以及乙醇水化，用PBS液進行3次洗滌，每次3min；用含量為3%的雙氧水處理5min；再用PBS液進行三次洗滌，每次3min；用pH值為6.2的檸檬酸進行高溫修復；再次用PBS液進行3次洗滌，每次3min；在一抗室溫狀況下孵育1.5h；依舊用PBS液進行3次洗滌，每次3min；于二抗室溫狀況下孵育30min；再用PBS液進行3次洗滌，每次3min，用DAB實現顯色，通過顯微鏡對顯色情況進行觀察，并選擇在合適時機流水從而終止顯色反應。最后，用蘇木精對石蠟切片進行復染，做好脫水、透明以及對石蠟切片的重新固定。

1.3 判斷標準 通過光學顯微鏡對生精細胞進行觀察，如若發現細胞核或者細胞漿中出現黃色顆粒，即可認定為陽性表達。研究用顯微鏡倍數為400，對5個睪丸曲細精管橫切面視野進行隨機觀察。選用免疫反應評分(IRS)對SURVIVIN蛋白表達進行半定量分析，即用睪丸曲細精管橫切面內陽性表達的細胞所占百分比(PP)計分和染色強度(SI)計分相乘。其中，PP計分標準如下：百分比小于1%的，記為0分；百分比在1%-25%之間的，記為1分；百分比在26%-50%之間的，記為2分；百分比在51%-75%之間的，記為3分；百分比大于75%的，記為4分。SI計分標準如下：顯示無色的，記為0分；顯示淡黃色的，記為1分；顯示棕黃色的，記為2分；顯示褐色的，記為3分。SURVIVIN陽性表達評價標準如下：當IRS計分為0時，判定表達為陰性，IRS計分在1-4分之間時，判定表達為弱陽性，當IRS計分在5-8分之間時，判定表達為中度陽性，當IRS計分在9-12分之間時，判定表達為強陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示；兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義；SURVIVIN蛋白表達強度與生精功能障礙的關系采用Spearman相關性分析進行檢驗。

2 結果

2.1 SURVIVIN蛋白在各組睪丸組織中的表達 通過顯微鏡觀察提示，在生精細胞的細胞核中，SURVIVIN蛋白有陽性染色表達。結果如下：SURVIVIN蛋白在生精功能正常患者睪丸組織中，細胞核呈現出褐色，IRS計分9-12分，為強陽性表達；SURVIVIN蛋白在生精功能低下患者睪丸組織中，細胞核呈現出棕黃色，IRS計分為5-8分，為中度陽性表達；SURVIVIN蛋白在生精功能阻滯患者睪丸組織中，細胞核呈現出淡黃色，IRS計分為1-4分，為弱陽性表達；SURVIVIN蛋白在唯細胞支持綜合癥患者睪丸組織中，細胞核為無色，IRS計分為0分，為陰性表達(圖1)。

圖1 各組睪丸組織免疫組化圖示

2.2 不同類型無精子癥睪丸組織中SURVIVIN蛋白的陽性表達狀況 不同類型無精子癥睪丸組織中 SURVIVIN蛋白的陽性表達狀況 (表 1)；Spearman相關性分析結果顯示，相關系數為-0.785，P＜0.05，說明男性生精功能障礙的嚴重程度與SURVIVIN蛋白的陽性表達強度呈負相關性。

3 討論

根據相關臨床研究報告顯示，受到社會經濟發展節奏與人們日常行為習慣等的影響，目前在全球范圍內都存在著不同程度的不育癥問題，這導致越來越多的國家承受著人口低速增長的威脅[6]。導致男性不育的病因有許多，無精癥是眾多病因中比較典型的一種，無精子癥的定義為精液常規檢查中未見精子，且精液離心后鏡檢亦未見精子，重復3次檢查結果相同，排除不射精和逆行射精，即可診斷為無精子癥；無精子癥可分為非梗阻性無精癥(NOA)和梗阻性無精子癥(OA)。前者是由于睪丸本身功能障礙，不能產生精子；后者睪丸生精功能正常，但由于各種原因導致精道阻塞使精子無法排出體外而造成的無精子癥。根據相關臨床分析結果顯示，由于無精子癥導致的不育，約占男性不育癥的10%～15%，而男性無精或者重度少精的共同特點之一就是生殖細胞的過度凋亡[7]。與其他細胞的凋亡相似，精子的凋亡，也是由于各種生理或者病理因子導致的。正常狀態下，精子的生成速率很高，但其成熟率卻相對較低，精子中成熟部分的數量約占總量的25%-30%之間。在正常狀態下，生殖細胞的增殖與凋亡之間具有一定的均衡調節，這是保證精子正常生成的一個內在機制[8]。

表1 SURVIVIN蛋白在各組睪丸組織中的表達

因此，生殖細胞凋亡的過程，實際上就是避免精子過度產生，降低異常精子出現的概率，最大程度的保持精子的正常生成[9]。而凋亡抑制蛋白，可以有效的抑制細胞的凋亡。SURVIVIN是近些年新發現的一種凋亡抑制蛋白，并且被確認為是目前被發現的最強的凋亡抑制蛋白之一。目前許多資料顯示，SURVIVIN在腫瘤組織中表達水平較高，但越來越多的證據顯示，SURVIVIN并非是腫瘤特異性蛋白，其在人體造血系統中也可被檢出[10]；而人體造血與生精，兩者的過程是具有相似性[11]。已有文獻報道在小鼠的生精細胞中，有SURVIVIN表達[12]。但是，關于SURVIVIN在男性無精子癥患者睪丸組織中的表達研究，以及SURVIVIN與精子生成的關系，目前這方面的研究還比較少。

綜上，SURVIVIN與精子的生成有一定的關聯，對男性不育癥的診治有所幫助，本實驗還需進一步的研究，明確其在精子發生中的機制。

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