生物素化微細纖維肽結合IGF-Ⅰ對兔心肌細胞Akt蛋白表達及磷酸化的影響

胡云華，肖祖克

(江西省人民醫院，1、二部心內科；2、呼吸內科，南昌 330006)

胰島素生長因子 （IGF）主要包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ，它是一種廣譜的促生長因子，分別由70和65個氨基酸組成，IGF-Ⅰ是一個有效的心肌生長和存活因子，能促進梗死心肌血管生成，刺激心臟纖維細胞增生及膠原、纖維粘連蛋白基因的轉錄，誘發心肌細胞和神經干細胞的分裂、分化[1]；有實驗證明，缺乏IGF-Ⅰ的大鼠會在心肌梗死后增加編程性細胞死亡，而IGF-Ⅰ會在心梗后阻止這一過程。但是IGF-Ⅰ是一種微量蛋白，很容易彌散通過組織，使其作用信號過遠而不能持續表達，單純的應用也不能使其與周圍微環境中的細胞達到最有效的生物性結合[2]。為了使IGF-Ⅰ在局部微環境達到穩態而發揮最大作用，本實驗采用MichmeIE.Davis所設計的自我組裝的微細纖維肽來延長IGF-Ⅰ的作用。

1 資料與方法

1.1 材料 抗生物素蛋白鏈霉菌（中國酶聯免疫試劑盒銷售平臺），N-氟化甲氧羥基-ε-氨基己酸（上海宙元生物科技有限公司），106細胞 （ATCC細胞庫），TRI試劑Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司），Akt Antibody(CST)，p-Akt 1/2/3(Ser 473)-R 抗體(Santa Cruz)，RT PCR 引物（北京華大中生科技發展有限公司）；AMV逆轉錄酶 （日本takara），免疫組化abc試劑盒 （武漢博士德公司），瓊脂糖（美國promega）PE480熱循環儀（廣州立諾自動化設備有限公司），Pharma-cia LKB UltroScan XL掃描儀（美國LKB公司）。

1.2 實驗方法 自我組裝的微細纖維通過抗生物素蛋白鏈霉菌連接，在自我組裝鈦RAD16-Ⅱ肽（AcN-RARADADARARADADA-CNH2）中加入生物素分子，通過2個N-氟化甲氧羥基-ε-氨基己酸相結合，使用S35-抗生物素蛋白鏈菌素和1：100的生物素化肽結合，結合后在無菌蔗糖溶液中溶解，蔗糖的質量分數為0.01，高頻聲波分裂10 min，取106細胞懸浮于自我組裝肽中，自我組裝肽的質量分數為0.01，0.01ng/L與IGF-Ⅰ（0.20mg/L）結合，組裝后細胞在DMEM中培養14d，使用TRI試劑于曲率半徑5-10nm的軟硅支架上進行細胞3D培養。自我組裝的微細纖維肽和IGF-Ⅰ結合完成后，體外培養胎兔心肌細胞，分別以生物素化微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ和未結合的IGF-Ⅰ誘導IGF-Ⅰ下游區蛋白的Akt磷酸化。RT-PCR檢測肌鈣蛋白基因表達：取培養的兔心肌細胞，提取總RNA，肌鈣蛋白引物：上游序列：5-GCTAGCC TCTGGATTTGACG-3’，下游序列：5-ACCAGGACC AGAGGAAACCT-3’， 反應 條 件：94℃/45s，55℃/45s，72℃/1min，在 PE480熱循環儀上進行 35個循環。取15μl PCR產物進行瓊脂糖電泳，糖的質量分數為0.02，結果用Pharma-cia LKB UltroScan XL掃描儀作光密度掃描。

1.3 檢測指標 體外培養胎兔心肌細胞，分別以生物素化微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ和未結合的IGF-Ⅰ誘導IGF-Ⅰ下游區蛋白的Akt磷酸化，檢測Akt、p-Akt蛋白表達；培養兔心肌細胞，加入生物素化微細纖維肽結合的和未結合的IGF-Ⅰ，RT-PCR檢測肌鈣蛋白表達。

1.4 統計學分析 采用SPSS 11.0進行分析，計量資料采用均數±標準差，采用 t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。

圖1

2 結果

2.1 兔心肌組織Akt蛋白表達 生物素化微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ和未結合的IGF-Ⅰ心肌細胞Akt蛋白表達水平分別為 （1.9968±0.2010）（0.3765±0.06693），與未結合 IGF-Ⅰ相比，生物素化微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ心肌細胞中Akt蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），說明生物素化微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ有蛋白活性并能加強Akt蛋白的表達。

2.2 兔心肌組織p-Akt蛋白表達 生物素化微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ和未結合的IGF-Ⅰ心肌細胞 p-Akt蛋白表達水平分別為（2.0725±0.4791）（0.3651±0.2272），與未結合 IGF-Ⅰ相比，生物素化微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ心肌細胞中p-Akt蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），說明生物素化微細纖維肽結合IGF-Ⅰ有蛋白活性并能加強p-Akt蛋白的表達。

圖2

2.3 兔心肌組織肌鈣蛋白表達 生物素化微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ和未結合的IGF-Ⅰ心肌細胞肌鈣蛋白表達水平分別為 （1.1573±0.0686）（0.6192±0.0497），與未結合 IGF-Ⅰ相比，生物素化微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ心肌細胞中肌鈣蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），說明生物素化微細纖維肽結合IGF-Ⅰ有蛋白活性并能加強肌鈣蛋白的表達，增加蛋白質合成。

圖3

3 討論

PI-3K/AKT是多種信號轉導途徑的共同通路，經磷酸化過程激活后，便可對下游蛋白進行調節，AKT可磷酸化并促使一些目標失活，促進細胞存活，最終抑制細胞凋亡[3-6]。在PI3K/Akt信號通路中，IGF-Ⅰ是一個非常有效的心肌增長和存活因子，是PI3K激活下游分子Akt的重要效應分子[7-10]。已有研究證實，IGF－1可以通過激活PI3K/Akt信號通路，且IGF-Ⅰ對心肌細胞的保護作用大多通過激活PI3K/Akt通路發揮作用，從而抑制心肌細胞的凋亡[11，12]，但是 IGF-Ⅰ是一種微量蛋白，很容易彌散通過組織，使其作用信號過遠而不能持續表達[11-13]，為了使IGF-Ⅰ在局部微環境達到穩態而發揮最大作用，本實驗采用MichmeIE.Davis所設計的自我組裝的微細纖維肽來延長IGF-Ⅰ的作用，自我組裝肽是一種寡肽，由交替的親水性和疏水性的氨基酸組成，在生理性滲透壓和PH值環境下可以迅速組裝成極小的微細纖維結構，被注射到心肌中形成3D的細胞微孔微環境，可以在特定的局部微環境中發揮持久的作用[14-17]。實驗結果表明生物素化的微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ使得兔心肌細胞的Akt、p-Akt蛋白、肌鈣蛋白的表達顯著增加，這說明生物素化的微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ不但保留了IGF-Ⅰ原有的生物活性，而且作用更持久，避免了IGF-Ⅰ作用不能持久的缺陷。

綜上所述，生物素化微細纖維肽結合的IGF-Ⅰ有蛋白活性，并且能明顯增加兔心肌細胞中Akt、p-Akt蛋白、肌鈣蛋白的表達，作用較IGF-Ⅰ更優，為其在實際應用中提供了參考。

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