以正交設(shè)計法優(yōu)選金連利耳口服液提取工藝參數(shù)

王麗鳴 于秀華

分泌性中耳炎目前被定義為“不伴有耳部急性感染癥狀和體征的中耳積液”，以耳痛、耳內(nèi)悶脹感或堵塞感、聽力減退及耳鳴為最常見癥狀[1]。小兒分泌性中耳炎發(fā)病率有逐年增高的趨勢，也是兒童最常見的致聾原因，僅次于藥物性聾。因此開發(fā)研究治療此類病癥的制劑有社會意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津），SPD-10AVP檢測器，C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Lambda25型紫外分光光度計（美國PE分析儀器廠），CP225D型雙量程電子分析天平（德國 Sartoris），KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品

黃芩苷對照品（中國藥品生物制品檢定所）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 吸水率測定

稱取原處方量的藥材總重76 g，加入總量的4倍水，密封，每30 min測一次體積，3 h后吸水量不再增加，測得吸水量為128 ml，所以該處方吸水率為2倍。選擇加水量為藥材的4倍、6倍、8倍。

2.2 水煎提取工藝正交實驗設(shè)計

對本處方的理化性質(zhì)、化學成分的研究分析后，制訂了該處方制劑中各藥材的提取方法，黃芩苷為其主要活性物質(zhì)之一，且該處方中的金銀花、黃芩、連翹等主要有效成分水溶性均很良好[2]，所以以水為提取溶劑，采用煎煮法進行提取。按原處方比例稱取金銀花、黃芩、連翹等 9 份，每份試驗藥材總重76 g，黃芩精密稱定，以加水量（A）、提取時間（B）和提取次數(shù)（C）為考察因素，采用三水平三因素L9（34）正交試驗，以黃芩苷含量和干浸膏得率為評價指標，通過正交試驗法對金連利耳口服液的提取工藝進行優(yōu)選。因素水平表見表1，正交試驗結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果見表3。

2.3 黃芩苷含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗[3-4]色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：甲醇-水-磷酸 -（45∶55∶0.2）；檢測波長：280 nm；柱溫：室溫。

應(yīng)用預(yù)選的實驗條件對供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液進行測定，其理論塔板數(shù)、分離度、保留時間、拖尾因子均符合要求，表明此色譜條件可行。

2.3.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成0.1 mg/ml 的溶液，作為對照品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0 μl，注入液相色譜儀，測定，以峰面積積分值（Y）為縱坐標，以對照品（X）進樣量為橫坐標，繪制標準曲線及回歸方程。

表1 金連利耳口服液水溶性成分提取工藝因素水平表

表2 水提L9（34）正交試驗表

表3 黃芩苷含量方差分析結(jié)果

2.3.4 供試品溶液制備 取1～9號樣品各適量，精密稱定，精密加入70%乙醇30 ml，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，稱重，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.5 樣品測定 按照2.3.1條件測定樣品。

2.3.6 統(tǒng)計方法 試驗中全部的數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。采用方差分析，P為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義；P＜0.01 為差異具有顯著統(tǒng)計學意義。

2.4 水煎提取工藝結(jié)果

根據(jù)正交實驗表及黃芩苷含量的方差分析表可知，提取次數(shù)（C）對處方中的黃芩苷含量影響最為顯著，加水量（A）影響次之，提取時間（B）影響最小，優(yōu)水平為C＞A＞B，且C3＞C2＞ C1，B3＞ B1＞ B2，A2＞ A3＞ A1優(yōu)組合為 C3＞ A2＞ B3。所以該實驗選擇的組合為C3A2B2，即提取次數(shù)為3次，加水量為6倍，煎煮時間為1.5 h。

2.5 醇沉濃度的選擇

取原處方量按照最佳加水煎煮，濾液濃縮至1.10～1.15（80℃），取等量三份，分別加乙醇使最終濃度為60%、70%、80%，放置（4℃）24 h，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，蒸干，減壓真空干燥，測出膏率。測得的三者的出膏率分別為7.74%、7.37%、5.58%。

分別取水煎處理液3份，精密稱定，分別加乙醇40 ml至乙醇最終濃度為60%、70%、80%，稱重，超聲處理30 min，放冷，稱重，分別加60%、70%、80%濃度的乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾液置100 ml量瓶中，分別用少量60%、70%、80%濃度的乙醇分次洗滌所用容器和殘渣，洗液濾入同一容量瓶中，分別加60%、70%、80%濃度的乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。結(jié)果測得的黃芩苷的量分別為44.42 mg/g、39.78 mg/g、40.20 mg/g。

結(jié)果：以60%乙醇為提取溶劑所得樣品出膏率最多，且黃芩苷含量最高，因此選用60%乙醇為最終溶液含醇量。

3 討論

黃芩歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)。通過現(xiàn)代的研究結(jié)果得知，黃芩當中是以黃酮類化合物為主要的活性成分，而且中黃芩苷的含量最高且其藥理作用最為明顯[5-7]。相關(guān)實驗表明，黃芩總黃酮可以明顯將小鼠強迫游泳以及懸尾實驗所需花費的時間縮短，因此，其具有潛在的抗抑郁的效果[8]。

[1] 徐曉霞，周美萍，張小英. 疏風解毒膠囊治療小兒急性非化膿性中耳炎臨床觀察[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（1）：368-370.

[2] 魯寅生，梁艷. RP－HPLC法測定小兒柴桂退熱顆粒中芍藥苷和黃芩苷的含量[J]. 西北藥學雜志，2017，32（5）：313-315.

[3] 張德靜，牛小彩. 復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑中黃芩苷含量測定[J]. 上海醫(yī)藥，2017，38（5）：66-69.

[4] 韋瑀龍，藍曉慶，黃敏，等. 復(fù)方感冒顆粒特征圖譜與黃芩苷含量測定方法研究[J]. 西部中醫(yī)藥，2017，30（3）：27-31.

[5] 李欣，魏朔南. 黃芩的生物學研究進展[J]. 中國野生植物資源，2006，25（6）： 11-15.

[6] 徐丹洋，陳佩東，張麗，等. 黃芩的化學成分研究[J]. 中國實驗方劑學雜志，2011，17（1）：78-80.

[7] 栗俞程，沈繼朵，劉亞敏，等. 黃芩主要黃酮成分的抗抑郁活性篩選[J]. 中國實驗方劑學雜志，2012，18（11）：166-169.

[8] 栗俞程，李寒冰，張賓. 黃芩總黃酮對小鼠的抗抑郁作用[J]. 中國實驗方劑學雜志，2011，17（23）：168-170.