維生素D對大鼠腦外傷海馬組織自噬及細胞凋亡的影響①

姚佳，朱莉，郭鑫，徐鵬飛，江沛，崔昌萌

1.濟寧市第一人民醫院，山東濟寧市272000；2.華北理工大學，河北唐山市063000；3.濟寧醫學院附屬醫院，山東濟寧市272000

腦外傷(traumatic brain injury,TBI)是神經外科高發疾病之一，容易發生在中青年人群中，也是致殘率、死亡率較高的疾病[1]。TBI引起的不良后果，如腦組織損傷和神經功能障礙等，是由于原發性損傷和繼發性損傷共同所致[2-3]，所以了解TBI的進展過程，預防或減輕繼發性腦損傷，是減少患者死亡率和改善生活質量的有力保證。目前針對腦損傷所致神經元死亡的研究大多集中在細胞凋亡方面，其凋亡通路及發生過程已較為明確[4-5]。

近年來，自噬引起國內外學者的廣泛重視[6-7]。有研究表明，微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)參與自噬延長階段[8]，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ被通常用作檢測哺乳動物自噬活性的重要指標[9]。最近自噬流已在許多動物模型上通過對自噬底物p62水平的檢測加以說明[10]，p62可伴隨自噬流一起被水解，出現水平降低；當自噬流障礙時水平升高。自噬在許多生理及病理情況下均可以被激活，如低氧、營養缺乏、線粒體功能異常、氧化應激、內質網應激及使用某些藥物治療等[11]。

近年來，動物實驗和臨床試驗表明，活性形式的維生素D3(vitamin D hormone,VDH)治療能夠改善TBI導致的認知功能缺損和精神障礙[12-13]。本實驗通過建立大鼠TBI模型，研究低濃度VDH對大鼠海馬組織內LC3、p62蛋白表達和凋亡的影響，為臨床腦損傷的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Sprague-Dawley大鼠45只，清潔級，體質量(260±20)g，由華北理工大學動物實驗中心提供。購入后在動物房適應性喂養1周，在室溫(23±2)℃、相對濕度50%～65%標準環境下喂養。大鼠分為對照組(n=15)、模型組(n=15)和VDH組(n=15)。

1.2 試劑

VDH：美國SIGMA公司。DAB顯色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。水合氯醛：北京中杉生物工程有限公司。TUNEL檢測試劑盒：美國ROCHE公司。兔抗β-actin多克隆抗體、兔抗LC3多克隆抗體、兔抗p62多克隆抗體：美國SANTA CRUZ公司。

1.3 造模

TBI模型制作方法參考相關文獻[11]報道有所改良。所有大鼠術前禁食12 h，禁水4 h。腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg麻醉大鼠，用大鼠腦立體定向儀將其頭部固定。將大鼠頭頂部手術區3×2 cm備皮，反復消毒3次后，于右側頂部，做正中矢狀位切口，并以矢狀縫左旁2 mm、前囟后2 mm為圓心，用顱骨鉆磨出一個直徑6 mm的骨孔。用鑷子小心去除骨瓣，充分暴露硬腦膜。將顱腦創傷儀的撞擊頭對準大鼠骨孔，使撞擊頭與硬腦膜表面緊密貼合，按下按鈕，完成撞擊。撞擊參數設置：撞擊頭直徑3 mm，撞擊速度5 m/s，硬膜下陷深度2.5 mm，撞擊時間持續500 ms。撞擊完成后將大鼠頭皮縫合，待麻醉復蘇后將其放回籠中飼養。

對照組釆用同樣的麻醉及手術操作，不經撞擊處理。

1.4 治療方法

VDH組分別于TBI造模后30 min、24 h、48 h腹腔注射VDH 1μg/kg[14]。VDH溶于5%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中。其余組在相同時間點腹腔注射等體積5%DMSO。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 細胞凋亡檢測

造模后3 d，每組取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg麻醉大鼠，取全腦，海馬區切片，按TUNEL檢測試劑盒進行操作。①石蠟切片二甲苯浸洗透明5 min，共2次；②依次用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)浸洗3 min；③組織用Proteinase K工作液處理15 min；④PBS漂洗5 min，共2次；⑤加TUNEL反應混合液50μl，暗濕盒中37℃恒溫箱中反應1 h；⑥PBS漂洗3 min，共3次；⑦組織切片上加DAB底物50～100μl，25℃恒溫箱中反應10 min；⑧PBS漂洗3 min，共3次；⑨蘇木素復染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；⑩光學顯微鏡下觀察海馬區凋亡細胞并計數陽性細胞。

1.5.2 Western blotting

造模后3 d，每組取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg麻醉大鼠，斷頭取腦，提取海馬組織進行定量。將40μg蛋白與2×上樣緩沖液按體積1∶1比例混合，開水煮沸5 min，選擇15%SDS-PAGE/5%積層膠上樣，電泳，轉膜，封閉2～3 h，加入兔抗LC3多克隆抗體、兔抗p62多克隆抗體及兔抗β-actin多克隆抗體，4℃搖床過夜，用TBST洗膜10 min，共3次；加入二抗，室溫下孵育1 h，再次用TBST洗膜10 min，共3次；DAB顯色，圖像分析儀(美國BIO-RAD公司)測定光密度，計算目標蛋白與β-actin的比值進行定量分析。

1.5.3 Morris水迷宮測試

Morris水迷宮測試為至今應用最為廣泛的研究空間學習記憶功能的方法[15]。所有大鼠在造模前通過訓練，使大鼠學會游泳，找到安全島的時間沒有差異。在TBI后第5、6、7天進行實驗。測試開始前，將直徑12 cm、高28 cm，且黑色不透明的安全島，隨機放于水迷宮四個象限中的任一象限，加水至安全島上方2 cm處，溫度22～25℃。將大鼠隨機放入四個象限，使大鼠頭部朝向桶壁，找到安全島的時間控制在60 s內。在水迷宮上方安置攝像探頭，計算機自動記錄、拍攝和統計大鼠從其他三個象限找到安全島的軌跡和潛伏期。如果60 s內大鼠沒有找到安全島，將其放在平臺上20 s，潛伏期記為60 s。

1.6 統計學分析

采用SPSS 20.0對實驗數據進行統計分析。實驗數據為計量資料者，采用(xˉ±s)描述，不同組別比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK法。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 細胞凋亡

TUNEL陽性細胞呈棕黃色，細胞胞核著色。模型組TUNEL陽性細胞數顯著多于對照組(P＜0.001)，VDH組TUNEL陽性細胞數顯著少于模型組(P＜0.001)。見表1、圖1。

2.2 LC3蛋白和p62蛋白表達

模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62表達均明顯高于對照組(P＜0.01)，VDH組明顯低于模型組(P＜0.01)。見表2、圖2、圖3。

2.3 Morris水迷宮測試

模型組逃避潛伏期明顯長于對照組(P＜0.01)，VDH組逃避潛伏期短于模型組(P＜0.05)。見表3。三組大鼠第5、6、7天的平均游泳速度無顯著性差異(P＞0.05)。見表4。

表1 三組TUNEL陽性細胞數

表2 三組海馬組織內LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62表達

表3 三組水迷宮測試逃避潛伏期比較(s)

表4 三組在水迷宮測試平均游泳速度比較(cm/s)

圖1 三組海馬組織內細胞凋亡情況(TUNEL染色，400×)

圖2 三組海馬組織內LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比較

圖3 三組海馬組織內p62表達

3 討論

本實驗結果表明，VDH在水迷宮試驗中顯著降低TBI大鼠的逃避潛伏期，證明VDH的神經保護作用，與國內外多項研究相符[15-16]。

腦出血后的自噬由多個步驟組成，包括自噬的介導、自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體、自噬溶酶體的降解。自噬流是這些步驟在細胞內連續出現的動態過程，自噬流中的任一環節出現障礙自噬將無法完成其生物學功能。

LC3是酵母ATG8的同源物，定位于自噬體內外膜，參與自噬延長階段[8]，其有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種存在形式，LC3Ⅱ在自噬體形成中起著關鍵作用，其與LC3Ⅰ的比值被通常用作檢測哺乳動物自噬活性的重要指標[9]。p62是一種指引泛素化蛋白進入自噬體進行降解的連接蛋白，可伴隨自噬流一起被水解，當自噬流障礙時水平升高[17]。

本實驗結果表明，TBI導致大鼠海馬組織內自噬流的障礙，而VDH能夠緩解TBI后自噬流的障礙，這或許是其在大鼠TBI后發揮神經保護作用的機制之一。

對應激狀態下的腫瘤細胞給予自噬抑制劑氯喹干預后，促進腫瘤細胞死亡，提示自噬可以在應激狀態下維持腫瘤和正常細胞的存活[18]。鋅離子同樣可以激活并增強自噬活動，清除海馬區變構或錯誤折疊的β-淀粉樣蛋白和tau蛋白，對防治海馬損害引起的認知功能障礙有重要作用，說明激活自噬有益于疾病的恢復[19]。Zheng等[20]發現，腦缺血可以促進自噬體和自噬溶酶體形成，提高LC3ⅡmRNA和蛋白表達水平，而自噬可能會加重神經元損傷。但有學者利用敲除Atg7基因的小鼠造成腦缺血模型，自噬活動消失，可見細胞內大量蛋白質聚集和神經元死亡，說明自噬能夠促進神經元的存活[21]。Sadasivan等[22]采用可控皮質沖擊損傷裝置制作腦外傷模型，發現急性腦外傷可以激活自噬，且自噬對腦功能的恢復具有促進作用。

以自噬機制為靶點治療疾病，不僅涉及自噬對神經元的直接保護作用[23]，且與其對免疫反應[24]及凋亡[25]、壞死機制的影響有關。在疾病發生發展過程中，自噬與凋亡、壞死機制之間的復雜聯系在學術界仍存在著諸多爭議。本實驗結果提示，自噬促進其神經功能恢復的機制或許與抑制神經元凋亡有關。

近年來，動物實驗和臨床試驗表明，VDH治療在TBI后發揮重要的神經保護作用[26-27]。另一方面，目前大部分學者更多地將VDH作為孕酮治療的輔助手段進行研究[28]，而關于VDH單體治療對TBI的神經保護分子機制研究還不夠深入。本研究并未涉及VDH影響自噬及凋亡的具體作用途徑及其分子機制，在今后研究中我們將引入激活劑或抑制劑進一步探討VDH在發揮腦保護的作用機制。

綜上所述，VDH治療能夠改善大鼠TBI后認知功能障礙，其分子機制與自噬的激活以及抑制神經元凋亡有關，VDH作為神經甾體，很可能成為一種頗有前景的TBI疾病治療藥物，其具有經濟實惠、較易獲取、不良反應少和能夠長期應用等優點，有望為TBI及其并發癥的治療打開新思路。

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