紅薯葉總黃酮對小鼠腦缺血缺氧保護作用的研究

楊敏 楊立軒 韋妮 馮潔 郭子鵬 凌秀孟 莫庸 韋金花 王俐 謝尤祥 馮雪萍

【摘要】?目的?探討紅薯葉總黃酮對小鼠急性腦缺血缺氧的作用。方法?制備紅薯葉總黃酮溶液，通過飽和MgCl2致小鼠急性腦缺血實驗、NaNO2中毒性缺氧實驗、常壓耐缺氧實驗和小鼠斷頭實驗，檢測急性腦缺血缺氧小鼠腦組織中總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和丙二醛 （MDA）含量變化。結果?與正常對照組比較，各給藥組小鼠的存活時間均延長，差異有統計學意義（P<0.05或0.01）;各給藥組腦指數和MDA含量均下降，T-SOD活性提高，差異有統計學意義（P<0.05）。結論?紅薯葉總黃酮溶液對腦缺血缺氧損傷有一定的保護作用。

【關鍵詞】?紅薯葉總黃酮;腦缺血缺氧;小鼠;保護作用

中圖分類號：R285.5?文獻標識碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.06.002

紅薯味甘，性平，具有補中、益氣、健脾、通便等多種功效，是我國主要農作物之一。現代科學研究表明紅薯莖、葉中富含各種化學成分，其提取物具有廣泛的醫療和保健作用。目前，對紅薯葉的研究主要集中在其提取物黃酮化合物及其功能、活性多糖及其功能和紅薯葉作為保健食品的開發利用等方面。研究證實，紅薯葉黃酮化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮痛、免疫調節、降血糖、治療骨質疏松、抗菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射、治療腹瀉等多重作用[1]。“藥食同源”是中醫推崇的疾病防治方法，經常食用紅薯葉有美容護膚，延年益壽的功效，在歐美、日本等國家及香港地區掀起一股“紅薯葉熱”，而在國內大部分地區紅薯葉卻被廢棄或作為動物飼料，沒有得到充分的利用。因此，對紅薯葉進行開發利用具有廣闊的市場前景[2]。目前為止尚未發現紅薯葉總黃酮對缺血性腦血管疾病的相關研究，本實驗通過構建四個經典小鼠急性腦缺血缺氧模型，觀察紅薯葉總黃酮對腦缺血缺氧的保護作用，并初步探討其可能的作用機制，為紅薯葉的開發利用提供實驗依據。

1?材料與方法

1.1?實驗材料

1.1.1?儀器

KQ5200DB型數控超聲波清洗器、電熱恒溫水浴鍋、旋轉蒸發儀、FSH-2A可調高速電動勻漿機、高速臺式離心機、722型分光光度計、FA（N）/JA（N）電子天平。

1.1.2?動物

SPF級昆明小鼠120只[由右江民族醫學院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（桂）2017-2003，使用許可證號：SYXK（桂）2017-0004]，雄雌各半，體重（20±2）g。小鼠在正式實驗前均在SPF級實驗室適應性飼養一周，自由采食和飲水。

1.1.3?藥品

紅薯葉（采摘于廣西百色市）;尼莫地平片（四川科倫藥業股份有限公司，生產批號：B160309015）;乙醇（分析純，生產批號：20170115，天津市富宇精細化工有限公司）;鈉石灰（生產批號：20170210，上海納輝干燥試劑廠）;總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒（生產批號：20170809）、丙二醛 （MDA）測定試劑盒（生產批號：20170806）和總蛋白測定試劑盒（生產批號：20170809），均購自南京建成生物工程研究所。

1.2?實驗方法

1.2.1?紅薯葉總黃酮的制備

（1）提取：采集新鮮的紅薯葉去雜、清水漂洗并瀝干其表面水分，（80±1）℃鼓風干燥72 h以上，冷卻后粉碎，過40目篩后，置干燥器備用。精密稱取紅薯葉粉末200 g，加2000 mL 70%乙醇，密閉浸泡過夜，超聲波提取2.5 h，抽濾。濾渣再加1500 mL 70%乙醇，超聲波提取1.5 h，抽濾，合并兩次濾液，旋轉蒸發，然后用乙酸乙酯萃取3次，真空干燥，得到紅薯葉粗制總黃酮粉末。（2）純化：將提取得到的粗黃酮化合物在AB8大孔樹脂柱上進行純化，用500 mL 60%乙醇洗脫，收集乙醇部分，減壓濃縮，在冷凍機中干燥得到純化黃酮。（3）鑒定：將純化后得到的總黃酮取少量溶于1 mL甲醇溶液試管中，加入濃鹽酸2～3滴，再加少量鎂粉，觀察到玫瑰紅色即可確定為紅薯葉總黃酮。（4）含量的測定：采用以蘆丁為標準品的比色法測定總黃酮含量。

1.2.2?小鼠急性腦缺血實驗[3]

1.2.2.1?飽和MgCl2致小鼠急性腦缺血實驗

SPF級昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，隨機分成三組：空白組、總黃酮提取組、尼莫地平組;每天灌胃，紅薯葉總黃酮提取組和尼莫地平組的給藥劑量分別為200 mg·kg-1、18 mg·kg-1，空白組用等量生理鹽水灌胃，連續7天，末次給藥1 h后，小鼠尾靜脈注射飽和MgCl2溶液（0.1 mL·10 g-1），記錄存活時間為從注射藥品至最后一次張口喘息的時間。

1.2.2.2?4%NaNO2溶液腹腔注射所致小鼠中毒性缺氧實驗

SPF級昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，分組及給藥方法同1.2.2.1，NaNO2給藥劑量為（0.1 mL·10 g-1）

1.2.2.3?常壓耐缺氧實驗

SPF級昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，分組及給藥方法同1.2.2.1，末次給藥1 h后，將小鼠放入裝有20 g鈉石灰的150 mL的帶塞的廣口瓶中，記錄小鼠從放入瓶中至停止呼吸的時間。

1.2.2.4?小鼠斷頭實驗

SPF級昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，分組與操作方法同1.2.2.1，末次給藥前稱重，給藥后1 h，迅速從小鼠耳后頸部斷頭，記錄小鼠張口喘息次數和喘息維持的時間，然后冰上取全腦，計算腦指數。再用9倍4 ℃生理鹽水將腦組織勻漿，制成10%勻漿液，離心取上清4 ℃保持備用。

1.2.3?小鼠腦組織中T-SOD和MDA的含量測定

取制備好的腦組織勻漿，參照試劑盒說明書進行操作。

1.3?統計學方法

采用SPSS 19.0 進行統計學分析，數據以（±s）表示，運用單因素方差分析（LSD 法）進行組間比較，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2?結果

2.1?總黃酮的含量測定

2.1.1?標準曲線的繪制

稱取蘆丁標準品10 mg，溶于100 mL 60%乙醇，分別精密吸取蘆丁對照液（0.10 mg·mL-1）0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10.00 mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min;再加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min;再加4%氫氧化鈉溶液4.00 mL，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置12 min，以試劑作空白參比液，于510 nm處測吸光度[4]。以蘆丁濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，繪制標準曲線，得到蘆丁溶液濃度（Y）與吸光度值（A）關系曲線的回歸方程式：Y=0.1468X+0.0019，絕對系數 R2=0.999。

2.1.2?樣品含量的測定

精密稱取樣品總黃酮10 mg，溶于100 mL 60%乙醇，吸取樣品液1 mL，置10 mL容量瓶，60%乙醇補足至刻度，測定吸光度，根據回歸方程計算樣品中總黃酮的含量為0.5 mg/mL。

2.2?紅薯葉總黃酮對3種模型小鼠耐缺氧存活時間的影響

由表1可知，與正常對照組相比，尼莫地平組和總黃酮提取組均能延長飽和MgCl2致小鼠急性腦缺血的存活時間，差異有統計學意義（P<0.05），也能延長NaNO2所致小鼠中毒性缺氧的存活時間，差異有統計學意義（P<0.01）;兩個給藥組均能顯著延長小鼠常壓耐缺氧的存活時間，差異有統計學意義（P<0.05或0.01）;尼莫地平組與總黃酮提取組比較差異無統計學意義（P>0.05）。

2.3?紅薯葉總黃酮對小鼠斷頭喘息的影響

由表2可知，與正常對照組比較，各給藥組均能增加小鼠斷頭后的喘息次數，差異有統計學意義（P<0.01），延長小鼠斷頭后的喘息維持時間，差異有統計學意義（P<0.01）;尼莫地平組與總黃酮提取組比較差異無統計學意義（P>0.05）。

2.4?紅薯葉總黃酮對急性全腦缺血缺氧小鼠腦指數及T-SOD和MDA含量的影響

由表3可知，與正常對照組比較，各給藥組腦指數和MDA含量均顯著下降，SOD活性顯著提高，差異有統計學意義（P<0.05）;尼莫地平組與總黃酮提取組比較差異無統計學意義（P>0.05）。

3?討論

缺血性腦血管病是危害人類健康的疾病，具有高發病率、高死亡率和高致殘率的特點[5]，發病機制復雜，難治愈，給家庭和社會帶來沉重的負擔。在腦組織發生缺血和缺氧的情況下，腦細胞會釋放大量的炎癥因子、興奮性氨基酸參與組織損傷過程，從而誘發腦功能障礙疾病[6]。腦缺血缺氧是一個復雜的病理過程，需及時進行治療，否則會導致腦損傷加重甚至死亡。目前治療缺血性腦損傷，主要是從抗谷氨酸受體、抗鈣超載、抗自由基這些途徑入手，至今尚無有效的治療方法[7]。腦缺血缺氧損傷是一個復雜的級聯反應，其損傷機制主要與自由基生成增多等因素有關[8]。已證實紅薯葉黃酮類化合物是一種很好的自由基清除劑[9]，可以提高老齡糖尿病大鼠的免疫力[10];改善模型動物體重，顯著降低內臟脂肪含量和空腹血漿胰島素水平，對非胰島素依賴型糖尿病小鼠具有降低血糖、血脂和增加抗氧化性的功能[11]，還可以改善糖尿病小鼠腎臟的損傷，對腎細胞具有良好的保護作用[12]。

當腦組織由于各種原因導致缺血缺氧時，就會產生大量炎癥因子，引起腦水腫，進而弱化血腦屏障功能，加速炎癥因子進入腦組織，加劇對腦部的損傷[13]。本實驗通過幾個經典小鼠腦缺血模型檢測紅薯葉總黃酮對腦的保護作用，結果提示：紅薯葉總黃酮可顯著延長飽和MgCl2所致急性腦缺血小鼠和NaNO2所致小鼠中毒性缺氧的存活時間，增加斷頭小鼠喘息次數，延長斷頭小鼠喘息時間，降低小鼠腦指數和MDA含量，提高T-SOD活性。實驗結果說明紅薯葉總黃酮對模型小鼠腦缺血后的功能具有一定的維持作用，能顯著提高模型小鼠腦組織中T-SOD的活性，降低MDA的含量，并能緩解由于腦組織在急性缺血缺氧的情況下造成的腦組織水腫。各實驗組均以尼莫地平作為陽性對照藥，結果表明尼莫地平能起到顯著緩解腦缺血缺氧的作用，驗證了其治療缺血性腦血管病的藥效。兩個給藥組相比較，紅薯葉總黃酮幾乎具備與尼莫地平同樣的抗腦缺血缺氧的藥效，因此可以推測長期食用紅薯葉可以達到預防腦血管疾病的目的。

總之，從實驗可以看出紅薯葉總黃酮具有很強的抗氧化性，可以減輕氧化應激對腦組織造成的損傷，對腦組織具有一定的保護作用，其保護機制可能與黃酮化合物具有直接清除氧自由基活性有關。另外，紅薯葉黃酮還是天然食品的提取物兼具無毒無副作用的優點，可以作為天然抗氧化劑來使用。但紅薯葉總黃酮對腦缺血缺氧疾病的最大有效給藥劑量和具體的作用機制還有待進一步深入探討。

參?考?文?獻

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