茶花“赤丹”組織培養(yǎng)芽誘導(dǎo)增殖技術(shù)研究

俞建妹 劉芳 劉玉軍 沈遐 盧德陽

摘要：指出了對(duì)茶花“赤丹”進(jìn)行組織培養(yǎng)，有利于芽誘導(dǎo)的外植體為一級(jí)分枝，通過試驗(yàn)得出：較理想的芽增殖培養(yǎng)基為ER（+Vc10mg/L）+6-BA2.5mg/L+IAA0.5mg/L+CH250mg/L，增殖系數(shù)可達(dá)6.7。

關(guān)鍵詞：茶花“赤丹”;組織培養(yǎng);芽誘導(dǎo);增殖

中圖分類號(hào)：S722.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2018）11-0060-03

1 引言

茶花“赤丹"（Camellia japonica‘Chidan）是山茶的一個(gè)品種，屬常綠灌木和小喬木，原產(chǎn)自中國(guó)華東地區(qū)，花朵碩大、艷麗、多變、活潑。但此品種較容易產(chǎn)生芽變，已形成一個(gè)龐大的“赤丹”系家族，其典型的突變品種有“粉丹”、“玉丹”、“鴛鴦鳳冠”、“鳳還巢”、“百萬富翁”和“醉?xiàng)铄钡龋跃哂泻芨叩挠^賞價(jià)值。本研究的茶花“赤丹”花大紅色，花瓣70多枚，呈8～9輪排列，花瓣質(zhì)地厚，中型花，直徑10cm，完全重瓣型，為茶花珍品，常被茶花愛好者所青睞。為了能保持該種的優(yōu)良遺傳穩(wěn)定性，規(guī)模化培育其苗木應(yīng)用于花卉市場(chǎng)，利用高科技的組織培養(yǎng)技術(shù)是最有效的途徑。

2 材料與方法

2.1 材料

試驗(yàn)材料來源于良鳳江國(guó)家森林公園（南寧樹木園）。以8年生，常年開花，花量大、花色艷麗的“赤丹”單株為對(duì)象，選擇根兜基部萌發(fā)的半木質(zhì)化或剛木質(zhì)化，生長(zhǎng)健壯的芽條作為外植體。

2.2 方法

2.2.1 外植體滅菌消毒

采集根兜萌芽條上一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)半木質(zhì)化或剛木質(zhì)化的枝條為外植體。在連續(xù)放晴3d以上的氣候采集枝條，首先剪去枝條的葉片，浸泡于5%洗衣粉溶液中，同時(shí)用軟毛刷輕輕擦洗表面污垢，流水沖洗30min，將剪成長(zhǎng)約5cm（至少帶1個(gè)腋芽）的莖段，用75%乙醇處理30s，無菌水清洗3次后，0.1%HgCl₂溶液浸泡15min，無菌水沖洗4～6次，每次2～5min，切除莖段兩端受傷組織，接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基ER中。每級(jí)分枝接種100顆莖段，統(tǒng)計(jì)接種后第6～30d的外植體污染率和褐化率。

2.2.2 始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

張建華[1]等研究發(fā)現(xiàn)，ER培養(yǎng)基比較適合茶花樹組織培養(yǎng)，因此，本試驗(yàn)始芽誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基選擇ER，6-BA、KT、ZT為芽誘導(dǎo)試驗(yàn)的細(xì)胞分裂素。將上述3種級(jí)數(shù)的無菌外植體分別接種于①ER+6-BA2.0mg/L+IAA0.5mg/L、②ER+KT1.0mg/L+IAA0.5mg/L、③ER+ZT0.5mg/L+IAAO.5mg/L的培養(yǎng)基內(nèi)。每種培養(yǎng)基接種每級(jí)數(shù)外植體20瓶，每瓶接種外植體1顆，3次重復(fù)。觀察記錄外植體始芽萌發(fā)時(shí)間、數(shù)量及其芽形態(tài)特征。

2.2.3 芽增殖培養(yǎng)

本試驗(yàn)采用L9（34）方法，設(shè)計(jì)4個(gè)因素（基本培養(yǎng)基、6-BA、IAA、CH），每個(gè)因素3個(gè)水平，共9個(gè)處理，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接芽1顆，3次重復(fù)，培養(yǎng)50d統(tǒng)計(jì)新芽增殖數(shù)量，計(jì)算各處理芽增殖系數(shù)。

2.2.4 葉片黃化的遏制

在繼代芽培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)芽葉片黃化至死現(xiàn)象。根據(jù)芽的葉片黃化特點(diǎn)，開展①添加VC（抗壞血酸）10mg/L，②使用有濾網(wǎng)的封口膜、③調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值等試驗(yàn)，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接芽5顆，3次重復(fù)，連續(xù)培養(yǎng)三周期，統(tǒng)計(jì)芽葉片黃化狀況。每周期30d。

2.3 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)除外，所有的培養(yǎng)基均附加白糖30 g/L，瓊脂5g/L，pH值為6.0。培養(yǎng)基在1.1mp，120℃高溫高壓條件下滅菌消毒20min。培養(yǎng)室溫度23℃±2℃，光照時(shí)間12～14h/d，光照強(qiáng)度800～3000Lx。新轉(zhuǎn)接的培養(yǎng)物，在800Lx光照條件下培養(yǎng)7～10d。

2.4 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013、SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同級(jí)數(shù)枝條滅菌的效果

連續(xù)15d采集萌芽條一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)半木質(zhì)化或剛木質(zhì)化枝條進(jìn)行滅菌消毒試驗(yàn)，枝條滅菌消毒效果統(tǒng)計(jì)：一級(jí)分枝不污染率70%;二級(jí)分枝不污染率61%;三級(jí)分枝不污染率55%。由此得知，一級(jí)分枝較于二級(jí)、三級(jí)分枝枝條的污染率低9%～15%。一級(jí)分枝離主桿最近，養(yǎng)分充足，生長(zhǎng)健壯，體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸快，新陳代謝旺盛，在相同濃度相同殺菌劑的條件下，對(duì)殺菌劑傷害的抵抗力較強(qiáng)，加速了傷口自我愈合速度，以降低褐化枯死率，較多地獲取無菌活體，能為下一步外植體芽誘導(dǎo)提供較豐富的試驗(yàn)材料。因此，一級(jí)枝條是滅菌消毒首選的外植體。

3.2 枝條級(jí)數(shù)與細(xì)胞分裂素對(duì)始芽誘導(dǎo)的影響

從表1可知，參試的細(xì)胞分裂素，在同一種類同一濃度條件下，芽誘導(dǎo)率大小排序?yàn)橐患?jí)枝條>二級(jí)枝條>三級(jí)枝條。一級(jí)枝條始芽萌發(fā)需要的時(shí)間也最短，添加ZT的培養(yǎng)基，僅培養(yǎng)21d始芽萌發(fā)了，所以選擇一級(jí)枝條作外植體，有利于始芽的誘導(dǎo)，加快芽培養(yǎng)速度。此原因可能在于一級(jí)枝條直接萌發(fā)于主干。發(fā)育早期的組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)，而發(fā)育晚期的組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力較差，甚至無轉(zhuǎn)化能力[2]。在細(xì)胞分裂素對(duì)腋芽誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響中可知，KT、ZT與6-BA對(duì)一級(jí)側(cè)枝誘導(dǎo)芽作用存在顯著性差異。KT與ZT較6-BA更容易促進(jìn)始芽萌發(fā)，但芽不健康。因此，適宜芽萌發(fā)的激素種類和濃度不一定適宜芽的生長(zhǎng)。為了培育生長(zhǎng)健壯的芽，利于下一步芽增殖培養(yǎng)，綜合始芽誘導(dǎo)率和芽形態(tài)特征表現(xiàn)，篩選出6-BA是比較適宜山茶“赤丹”外植體始芽誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素和濃度。

3.3 不同培養(yǎng)基配方對(duì)芽增殖效果的影響

從表2可知，6-BA對(duì)芽的增殖起主導(dǎo)作用。芽的增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的遞增，總體呈向上趨勢(shì)，處理9除外，處理3和處理6芽增殖系數(shù)為高，分別是8.0和7.0。其次是處理2、處理5和處理8，芽增殖系數(shù)在5以上。但處理3和處理6的叢芽均出現(xiàn)不同程度的玻璃現(xiàn)象，而處理2和處理5的叢芽生長(zhǎng)正常。原因可能是培養(yǎng)基中6-BA濃度為5.0mg/L，對(duì)山茶“赤丹”的莖尖和分生組織的細(xì)胞分化和生長(zhǎng)刺激作用過大，加上在培養(yǎng)基中添加了營(yíng)養(yǎng)豐富的CH，使培養(yǎng)物直接增殖不定芽形成試管苗的進(jìn)程快、時(shí)間短，部分分生組織還沒能來得及適應(yīng)新的環(huán)境[3]，而導(dǎo)致細(xì)胞分化受損，細(xì)胞質(zhì)稀薄、細(xì)胞壁發(fā)育不良之故。CH對(duì)不定芽的分化和生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，在含較高6-BA的培養(yǎng)基中添加CH濃度不宜過高。處理2和處理5中BA2.5mg/L，分別添加CH250mg/L和100mg/L，芽增殖系數(shù)雖然比處理3和處理6的分別低19.400，4.4%，但分化出的叢芽生長(zhǎng)健康。本試驗(yàn)采用的3種基本培養(yǎng)基，在適宜的6-BA和CH濃度條件下均能使增殖芽健康生長(zhǎng)。為了能培育出較多的健壯芽用于進(jìn)一步芽擴(kuò)繁及生根，綜合考慮芽的增殖系數(shù)及生長(zhǎng)情況，挑選出相對(duì)較優(yōu)的增殖配方為處理2。

3.4 不同方法對(duì)組培芽葉片黃化遏制效果的影響

一般情況下，茶花“赤丹”繼代芽培養(yǎng)到第6代時(shí)葉片出現(xiàn)黃化至枯死現(xiàn)象，為了改善或遏制此現(xiàn)象，根據(jù)茶花自然生態(tài)習(xí)性，將繼代了5代的“赤丹”增殖芽分別轉(zhuǎn)接到：①添加Vc10mg/L，②使用有濾網(wǎng)的封口膜封口，③調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值到5.5這3種不同處理方法的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3代，結(jié)果表明：第3種方法對(duì)培養(yǎng)物葉片黃化或褐化現(xiàn)象未得到良好的改善。添加Vc10mg/L的培養(yǎng)基中葉片黃化現(xiàn)象得到了有效的控制，新長(zhǎng)出的葉片第二代培養(yǎng)時(shí)已沒有出現(xiàn)局部黃化或褐化現(xiàn)象，第三代培養(yǎng)時(shí)，芽得到正常生長(zhǎng)。Vc是一種廣泛分布在植物中的維生素，在植物體內(nèi)參與電子傳遞系統(tǒng)中氧化還原作用，促進(jìn)植物新陳代謝[4]，提高植物抵抗干旱、臭氧和紫外線作用。完整植株是能夠制造維生素的，但是離體卻不能合成足夠的維生素[5]。可能是隨著“赤丹”繼代芽生長(zhǎng)速度的加快，Vc的合成不能滿足生長(zhǎng)的需求，新陳代謝減弱而導(dǎo)致芽的葉片黃化。使用有濾網(wǎng)的封口膜能增加瓶?jī)?nèi)氧氣輸人，促進(jìn)芽的新陳代謝，葉片黃化程度有所改善，但其效果次于添加Vc的。所以，為了培養(yǎng)健康的增殖芽，宜在培養(yǎng)基內(nèi)添加Vc10mg/L或培養(yǎng)容器使用有封口膜的瓶蓋，能比較有效地遏制繼代芽葉片黃化現(xiàn)象。

4 結(jié)論與討論

根兜萌芽一級(jí)分枝滅菌消毒效果較好，且開始萌芽時(shí)間短。其是最佳始芽誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素，濃度為6一BA2.0mg/L，萌芽率高且始芽健壯，能有效地接種入芽增殖培養(yǎng)基為ER（+Vc10mg/L）+6-BA2.5mg/L+IAA0.5mg/L+CH250mg/L中，叢生芽生長(zhǎng)快速，有側(cè)芽萌發(fā)，增殖系數(shù)可達(dá)6.7，且能遏制或改善增殖芽葉片黃化枯死現(xiàn)象，能滿足生產(chǎn)化育苗需要，進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

適宜始芽誘導(dǎo)6-BA濃度低于芽增殖培養(yǎng)的濃度，原因可能是外植體來源于一級(jí)分枝幼嫩組織，養(yǎng)分充足，細(xì)胞活躍，分裂能力強(qiáng)，本身含有較高的生長(zhǎng)激素水平，所以不需添加太多的外源激素，不定芽便能快速萌發(fā)。在瓶苗培養(yǎng)過程中出現(xiàn)黃化現(xiàn)象是否是培養(yǎng)物合成VC量不能滿足自己生長(zhǎng)需求，引起自身氧化還原效率低，新陳代謝緩慢而引起葉片黃化，或是否芽生長(zhǎng)代謝過程中排出的二氧化碳過多，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氧氣不足，造成二氧化碳中毒，引起葉片黃化，有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]張建華，毛平生，彭火輝.茶樹的組培快繁技術(shù)初探[J].蠶桑茶葉通訊，2003（4）：32～33.

[2]許鴻川.植物學(xué)（南方本）[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2010：166.

[3]李勝，李唯.植物組織培養(yǎng)原理與技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：36～37，10.

[4]張洪昌，李星林.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑使用手冊(cè)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011：118～119.