PHDs-HIFs-pVHL通路在類風濕關節炎中的研究進展*

宋小莉，蘇娟

（青海大學附屬醫院 風濕免疫科，青島 西寧 810001）

1 類風濕關節炎與缺氧

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵犯四肢關節為主要臨床表現的慢性多系統疾病。該病可造成關節強直、畸形及多臟器的損害，嚴重影響人們生活。RA病因目前尚不明確，可能與多種因素有關，包括遺傳因素、感染因素等等。多種復雜的致病因子共同參與RA關節破壞與全身的免疫紊亂過程。

局部微環境缺氧是炎癥的特征之一，缺氧可以誘導炎癥，反之炎癥可以加重缺氧。缺氧使細胞觸發適應性反應，導致缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）過度表達，HIF具有廣泛的靶基因譜，可廣泛的調控炎癥的發展，炎癥細胞的代謝等。RA主要病理特點是滑膜炎，滑膜炎中特征性的病變是血管翳的生成。近年來，缺氧參與RA的發生及發展也逐漸受到廣大學者的關注。上世紀70年代LAUDOLESEN等就報道RA關節中呈現缺氧的特征，RA患者關節腔內氧分壓是3.60 kPa，而OA組為5.73 kPa，正常對照組的氧分壓為8.40 kPa。RA患者關節腔微環境缺氧，氧感受通路相關因子異常活化，在RA病理過程中發揮重要作用[1]。

1.1 脯氨酸羥化酶-缺氧誘導因子-系佩爾林道腫瘤抑制蛋白通路

當氧分壓正常時，HIF-α與氧通過脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain，PHD）發生羥化反應，然后同希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白（von-Hippel-Lindau tumor suppressor protein，pVHL）結合形成復合物，經pVHL介導的E3泛素-蛋白酶體途徑發生降解。同時，HIF-1的抑制因子（factor inhibiting HIF-1，FIH-1）通過催化HIF轉錄活化結構域（TAnC），抑制轉錄輔助激活因子P300/CBP與TAnC結合，使HIF-α的轉錄活性受到抑制。反之，缺氧條件下PHD的羥化作用受抑，阻礙HIF-α與pVHL結合，導致HIF-α降解減少，下游靶基因如促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、八聚體結合蛋白-4（octamer-binding protein-4，OCT4）及金屬蛋白酶（metalloproteinase，MMPs）等表達增加[2]。同時，低氧抑制FIH-1羥化作用，促進TAnC與P300/CBP結合，提高HIF-α轉錄活性[3]。機制見附圖。

附圖 PHDs-HIFs-pVHL通路機制

1.2 HIFs

1.2.1 HIF生物學特點 HIF最早是從人肝癌細胞的細胞核中提取出來，包含2個亞基的異二聚體，1個是可被氧壓調節的HIF-1α及持續表達的亞基HIF-1β。2個亞基都屬于基本的螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）轉錄因子超家族成員，具有Per-AHR/ARNT-Sim（PAS）結構域。其中，HIF-α有3個亞基，HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α，關注較多的是HIF-1α和HIF-2α，HIF-3α研究報道較少。HIF-1α和HIF-2α具有相似的結構及功能，HIF-1α在各組織中廣泛表達，而HIF-2α限制于特殊的組織類型，如肺內皮細胞、腎腫瘤細胞、成骨/破骨細胞及肝、卵巢上皮細胞等。在常氧條件下，PHD在氧依賴的降解結構域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD）與脯氨酸殘基結合，導致HIF-1α降解。在缺氧條件下，HIF-1α的降解受抑制，在胞質中聚集并轉移到細胞核中與HIF-1β結合形成二聚體，激活下游靶基因[4]。

1.2.2 HIFs與RA RA典型的病理特征是成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synovial cells，FLS）的異常增殖和血管翳的產生。FLS的異常增殖導致新生細胞對氧的需求增加，誘導更多的新生血管生成，但新生血管的結構和功能異常，并不能完全改善滑膜組織缺氧，反而加劇滑膜炎癥產生。研究表明[5]，HIF-1α在RA的滑膜組織中與血管的新生呈正相關，FLS中的高遷移率族蛋白1（high-mobility group box protein 1，HMGB1）可與其Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）結合上調HIF-1α促進VEGF的產生，誘導血管生成。FU等[6]指出，HIF-1α通過促使上皮間質轉化因子擴增導致骨髓間質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）增加，下調E2A-p21通路，增加基質細胞衍生因子受體-4（cxc chemokin receptor 4，CXCR4）和VEGFR1，促進基質細胞衍生因子1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）和VEGF的表達，導致骨的新生血管生成。HIF-1α還可調控其他的血管生成介質，如一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、趨化因子 -8、CC亞族趨化因子配體20（chemokine cc-motif ligand 20，CCL20）等共同作用于血管，導致其通透性增加，調控內皮細胞因子，如酪氨酸激酶受體Tie-2、纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）和血小板源生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF），使得內皮細胞增殖、遷移增多，加速血管重建，導致血管新生，參與血管翳的發生[7]。

DANG等[8]發現，HIF-1α可以調節Treg細胞和Th17細胞分化之間的平衡，HIF-1α通過轉運激活Treg細胞，活化Th17特異轉錄因子維甲酸受體相關孤兒受體（retinoid-ralated orphan receptorγt，RORγt）和促RORγt絡合物的形成，促進P300結構域中IL-17的形成，調節Th17信號基因，增加Th17細胞的表達。HIF-1α還可通過與Foxp3結合，減弱Treg細胞的蛋白酶活性。在缺乏HIF-1α的小鼠進行誘導實驗性自身免疫性腦炎后出現Th17細胞減少和Treg細胞增加。Treg和Th17細胞在RA中的重要調控作用，已得到廣泛認同[9]。HIF-1α在RA中是否也通過調控T細胞參與發病，值得進一步研究。

在RA中，HIF-1α通過上調CXCR4、MMPs等促進FLS的遷徙和侵襲，加劇RA關節滑膜的破壞[10]。LI等[11]發現，在低氧條件下IL-17A通過NF-κB信號通路使HIF-1α表達增加，當抑制HIF-1α和NF-κB時，RA中FLS的遷徙和侵襲減弱。HIF-1α還可增強 MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、白介素-8（interleukin-8，IL-8）及IL-1β的表達，加劇骨侵蝕[12]。

RYU等[13]通過小鼠實驗發現，在小鼠膝關節內通過注射腺病毒導致關節中HIF-1α和HIF-2α增加，一段時間后，HIF-2α組較HIF-1α組出現更典型的滑膜增生、滑膜炎、軟骨破壞及新生血管增加等RA病理表現。基因敲除HIF-2α，可導致細胞因子表達下降，如 IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17A、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素 -γ（interferon-γ，IFN-γ）等，表明HIF-2α或也參與RA的發展。

此外，HIF-1α誘導6-磷酸-1-激酶以及葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter-1，GLUT1）、GLUT3表達增多，還可活化丙酮酸脫氫酶激酶1，進而阻斷線粒體氧化促使糖酵解產生增多，使得RA關節腔內缺氧加劇，正反饋激活HIF-1α[14]。

HIF-1α直接激活炎癥因子，明確的有TNF-α、IL-1、IL-6、IL-33、IL-17、IFN-γ參與 RA炎癥的發生、發展[15]。由此可見，HIFs可能通過調控新生血管增生、骨侵蝕、免疫細胞活化、糖酵解及炎性細胞因子的產生等方面參與RA的發生及發展，進一步研究HIFs在RA中的作用具有重要意義。

2 pVHL

2.1 VHL生物學特性

希佩爾林道病腫瘤抑制基因（von Hippel-lindau，VHL）是位于3p25～26號染色體的抑癌基因。VHL有2個亞型，1個含有大量的酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點，導致細胞內的磷酸化。另1個主要位于甲硫氨酸內部起始翻譯產物，兩者統稱pVHL。其主要含有2個區域，即α和β區域，α區域主要影響整個蛋白構象，而β區域無影響。在常氧條件下，HIF-α可通過pVHL介導的HIF泛素化而降解，PHD在HIF-α氧依賴結構域上的pro402和pro564位處發生羥化反應，再與pVHL的β區域結合后發生降解。當缺氧條件下時，PHDs活性受到抑制，HIF-α聚積，轉運到細胞與HIF-β亞基形成聚合體，激活下游靶基因。當pVHL蛋白缺失時，可在常氧條件下進入核內與β亞基結合，增加HIF-α的轉錄活性[16]。

2.2 VHL與RA

目前尚未見到有關VHL與RA相關的研究報道。但VHL在骨代謝、血管新生、炎癥以及代謝調節方面均具有調控作用。研究發現，缺氧狀態下，HIF-α可激活VEGF和磷酸甘油激酶促進低氧區軟骨細胞的存活，而條件性剔除VHL可以導致HIF-1α的表達增加，使得軟骨細胞存活增加，但條件性敲除軟骨細胞的VHL基因，導致HIF-1α增加，有絲分裂活性降低，生長板軟骨細胞出現不典型的細胞增大，軟骨細胞存活率反而下降[17]。WENG等[18]研究發現，在小鼠軟骨細胞生長板的發育中，VHL的剔除可以導致基質沉積的增加，細胞增殖減少，加劇細胞凋亡，還可以抑制軟骨細胞中自噬基因，如LC-3、Bcl-2的表達，導致自噬細胞細胞器中的大分子不能移除，軟骨細胞內穩態失衡，引起軟骨的退化。

VHL的缺乏可以增加HIF-2α的表達及下游靶基因MMP-13及IL-6的水平，加速小鼠骨關節炎的發生、發展。MANGIAVINI等[19]指出，VHL參與軟骨內細胞的形成，原因可能是在生長板的發育中，HIF-1α及VHL參與間葉細胞分化為成骨細胞過程。在缺失VHL基因的小鼠軟骨細胞中，間葉細胞表現為數量的減少、增殖受損、體積變大而死亡、生長板中二次分化中心的缺乏，影響軟骨細胞的發育及成熟。另外，VHL缺乏還可以激活NF-κB通路導致破骨細胞分化及骨吸收增加，加劇骨破壞[20]。

VHL在血管新生方面也具有重要意義。SCH?NENBERGER等[21]發現，血管內膜中VHL的減少可引起血管內皮細胞的擴增，并導致小鼠腎臟髓質血管化的形成，其主要機制是由于HIF-1α降解減少，過度激活下游VEGF、內皮細胞生長因子等靶基因。

刪除胸腺中的VHL可增加T細胞的凋亡，導致成熟T細胞的減少，而VHL缺乏可以增加 HIF-1α的表達促進Th17介導的炎癥應答[22]。在骨髓細胞中，HIF-1α調節ATP的產生、顆粒酶的合成及iNOS/NO的產生，而HIF-2α主要是調節細胞因子的產生，上調趨化因子受體參與巨噬細胞的遷徙。VHL缺乏時，HIF-1α和HIF-2α均可過度表達，從而產生更多的顆粒酶及iNOS/NO，增加巨噬細胞的活性，加強炎癥應答[23]。

HIF-1α調節葡萄糖的代謝已見報道，研究發現，VHL也參與葡萄糖的代謝。SAPNA等[24]通過研究小鼠中剔除VHL的胰腺β細胞發現，剔除VHL對β細胞的形態無明顯影響，但胰島素分泌受損。原因可能是在缺氧條件下，糖酵解導致丙酮酸鹽到乳酸鹽過程中ATP合成減少，剔除VHL的胰腺β細胞可上調HIF-1α依賴的丙酮酸脫氫激酶1的濃度，抑制丙酮酸鹽進入三羧酸循環，導致ATP產生減少，所以VHL的突變干預糖代謝的正常過程。ZEHETNER等[25]發現，選擇性的抑制VHL基因可激活NO-VEGF軸，VEGF通過增加內皮細胞iNOS的表達激活一氧化氮（nitric oxide，NO），造成小鼠胰島素抵抗，究其原因，可能是pVHL可與胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor I，IGF-I）競爭性的與活化的蛋白激酶1結合，pVHL抑制后，此競爭作用減弱，導致葡萄糖代謝受抑。

RA與炎癥的發生、血管新生、骨質破壞、代謝改變密不可分，而VHL在骨的發生、形成，骨改建及骨重建、血管新生、炎癥及代謝方面也有類似作用，故有理由相信VHL在RA可能也起著重要調控作用，有必要進行進一步研究。

3 PHDs

3.1 生物學特性

組織細胞中HIF-α蛋白穩定性與活性受到嚴密調節，HIF-α的羥基化是pVHL與其結合的必要條件。HIF-α脯氨酰殘基羥基化是其降解的關鍵，而催化此過程的PHD便是全過程的限速酶。PHD是一類依賴氧、α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）和Fe2+催化的非血紅素鐵依賴性加雙氧酶。目前主要發現有4種，即PHD1、PHD2、PHD3和PHD4。研究較多的主要是前3種，PHD1又名HPH3（HIF-prolylhydroxylase 3） 和 EGLN2（egg-laying deficient ninelike protein 2），PHD2又名 HPH2和 EGLN1，PHD3又名HPH1和EGLN3[26]，3種亞基的結構既相似又不同，他們都在C端的序列高度同源，但PHD2在N端獨有的鋅指結構PHD1和PHD3沒有。PHD1、PHD2可以羥基化HIF-1α pro402，而PHD3卻不可以。PHD1 mRNA可以表達于多種組織，其中以胎盤及睪丸組織中最多。而目前PHD2 mRNA研究最多，在許多組織中扮演重要作用，PHD3較PHD1及PHD2表達較少，主要在心臟及胎盤中表達[27]。PHD家族成員參與炎癥、造血、心肌保護、代謝、骨修復和骨再生已有報道[28-30]，目前其在RA中的研究也引起一定關注。

3.2 PHDs與RA

TAKEDA等[31]指出，在巨噬細胞中，PHD的抑制劑DMOG增加脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的TNF-α的活性，增加LPS誘導的NF-κB轉錄活性，PHD的增加可以減弱LPS誘導的細胞因子的產生，如TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS及IL-10，減輕炎癥反應。PHD抑制劑減少ROS，而HIF誘導ROS的產生加劇炎癥反應，那么PHD抑制或可減少炎癥的發生。

ZHU等[32]發現，剔除PHD1的小鼠會導致破骨細胞增加，成骨細胞減少，導致骨的再吸收增加。另外，在肺癌中，PHD1的過度表達可以抑制NF-κB的活性，抑制肺癌細胞的擴增，NF-κB既往研究證實其在炎癥、免疫、細胞增殖、分化中有重要意義，那么PHD1是否也通過NF-κB通路影響RA的發生、發展國內外尚未報道，值得進一步研究[33]。PHD2是調控HIF-1α最主要的亞型，近年來，PHD2在RA發病中的作用也日益受到重視。MUZ等[34]研究發現，RA患者的FLS中選擇性沉默PHD2，可上調促血管生長作用的因子，如EGF、血管生成素樣蛋白4（angiopoietin-like 4，ANGPTL4）、肝配蛋白A3（ephrin，EFNA3）、VEGF、瘦素蛋白（leptin protein，LP）導致RA患者新生血管的形成。LARSEN等[35]發現，在RA患者FLS中其活性由高到低分別是：EFNA3、ANGPTL4、VEGF及Leptin，以上因子促進不成熟血管的發生，導致血管翳的生成，促進RA的發展。此外，ANGPTL4還可刺激破骨細胞的吞噬，導致骨質流失，加劇RA的骨質破壞[36]。沉默PHD2還可以導致促凋亡蛋白BNIP3（BCL2/adenovirus E1B19 kD-interacting protein3，BNIP3）增加[35]，而BNIP3可促進線粒體的吞噬和減少氧化代謝，降低氧耗，導致RA中FLS細胞的增殖和存活[37]。SCHOLZ等[38]研究發現，PHD2可通過激活NF-κB上調炎癥IL-1β參與RA在內的多個炎性疾病的發生。

PHD3對調節氨基酸的生物合成、細胞分化、新陳代謝、血細胞生成和血管生成基因的活性轉錄因子 4（activating transcriptional factor，ATF4）有重要作用，但具體機制未明確闡釋[39]。沉默PHD3可以上調某炎癥因子如IL-8和IL-1β和成纖維生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR3）加劇炎癥在RA中的作用[34]。WALMSLEY等[40]通過急性肺損傷的模型研究，發現在缺氧條件下PHD3導致小鼠外周血中性粒細胞增加，其原因主要是持續低氧的環境導致中性粒細胞中HIF靶基因磷酸甘油醛脫氫酶活化，NF-κB通路激活，中性粒細胞增加，缺氧還可使脂多糖誘導肽聚糖促炎癥因子受體增加，導致中性粒細胞凋亡的延遲，增加的中性粒細胞可啟動并加劇炎癥反應。WALMSLEY等發現，在Phd-/-條件下，人類外周血中Siva1表達下調而BCL-XL表達增加，使得中性粒細胞增加，但PHD3可上調在RA外周血中性粒細胞數值，但具體機制未闡述。RA患者滑液中含有大量免疫復合物，中性粒細胞表現出極強的趨化、吞噬以及數量異常，PHD3是否可能通過調控中性粒細胞的數量及質量異常參與RA發病，值得進一步研究。SINGH等[41]指出，PHD3可以通過上調轉運因子Foxp3增加T細胞的活性，T細胞的活性主要是被CD4+/CD25+/Foxp3+調節來維持免疫系統自穩態。可能是因為PHD3過度表達影響HIF-1α的活性，增加CD25+調節性T細胞，干預Th17的分化，抑制Th17的發展。還指出轉化生長因子β（transform growth factor-β，TGF-β）參與CD25+調節性T細胞和Th17細胞的分化過程，既往研究報道HIF-1α可以激活TGF-β[42]，故當PHD3活性增加，HIF-1α表達減少，TGF-β生成降低，或可影響CD25+調節性T細胞和Th17細胞，但仍需進一步研究證實。因此推測，PHD3也可能通過對免疫細胞的調控參與RA免疫異常。

目前對于PHD4的研究較少，PHD4主要位于細胞內質網，活性位點主要位于細胞管腔，可能通過調節TNF-α來抑制血管的形成，但具體機制不詳。

綜上所述，PHDs-HIFs-pVHL作為重要的氧感受器通路，激活多種信號因子，發揮多重作用，但是PHDs-HIFs-pVHL在類風濕關節炎中具體如何起到調控作用，仍需進一步研究。通過對PHDs-HIFs-pVHL通路的研究不斷深入，明確低氧通路的靶點及對器官的損害機制。對防治RA發生、發展具有極其重要臨床意義，或為RA患者通過提供新的治療靶點。

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