RNA干擾沉默同源異型基因A5逆轉K562/ADM細胞耐藥性的研究*

高菲，劉文君

（西南醫科大學附屬醫院 兒科，四川 瀘州 646000）

白血病（leukemia）是一類造血干細胞異常的惡性克隆性疾病，是兒童最常見的惡性腫瘤，嚴重危害兒童的健康[1-2]，其治療主要是以化療為主的綜合性治療，而耐藥已成為白血病治療的一大阻礙。研究發現，同源盒（homeobox，HOX）基因的過表達可使細胞分化成熟障礙、造血能力降低，最終可導致造血系統惡性腫瘤的發生和發展[3-4]。作為HOX基因家族中的一員，HOXA5定位于7號染色體（7p15.2），其表達主要局限在粒-單核細胞系。據報道，HOXA5基因與腫瘤的耐藥性有關，但其作用機制不清[5]。近年來研究發現信號通路異常與白血病的發生、發展及其多重耐藥密切相關，其中p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）信號轉導通路異常是白血病耐藥的重要機制之一[6-9]，其主要參與細胞的活化、生長及凋亡。研究表明HOX基因與p38MAPK信號轉導通路的活化存在相關性[10]。因此，我們推測HOXA5基因可能通過p38MAPK通路逆轉K562/ADM的耐藥性。

RNA干擾（RNA interferene，RNAi）技術是雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）介導的序列特異性轉錄后引起同向靶基因表達沉默，具有快速、特異、高效等優點[11]。本實驗建立在前期設計并合成3條針對HOXA5的特異性有效siRNA序列，并通過相關檢測方法篩選出對HOXA5表達抑制效率最佳的1條siRNA序列的基礎上[12-13]，通過RNAi技術沉默HOXA5，探討p38MAPK信號通路在耐藥白血病細胞中的作用，為耐藥白血病的靶向治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人白血病耐阿霉素細胞株K562/ADM細胞（購自上海信裕生物科技有限公司），阿霉素（購自浙江海正藥業股份有限工司），RPMI 1640培養液和胎牛血清（購自美國Hyclone公司），二甲基亞砜（DMSO）（購自美國Sigma公司），100 u/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素雙抗、總RNA提取試劑盒、CCK8及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（購自碧云天公司），逆轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（購自日本ToYoBo公司），Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒及細胞周期檢測試劑盒（購自南京凱基生物科技有限公司），脂質體LipofectamineTM2000（購自美國Invitrogen公司），靶向HOXA5的siRNA序列、陰性對照siRNA序列（杭州艾迪康公司合成），兔抗人HOXA5多克隆抗體一抗（購自英國Abcam公司），兔抗人p38MAPK及p-p38MAPK多克隆抗體一抗（購自美國CST公司）。

1.2 細胞培養

將K562/ADM細胞懸浮于含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素雙抗、1 000 ng/ml阿霉素完全培養基中并接種在培養瓶，置于5%二氧化碳CO2的37℃飽和濕度的培養箱中連續培養。每2天更換1次培養液并傳代，實驗前細胞用無ADM的完全培養基培養2周，取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞的實驗分組及轉染 實驗先分為K562細胞及K562/ADM細胞組。然后以本課題組前期實驗為基礎對K562/ADM細胞進行轉染后再分為3組：實驗組（pRNAT-GFP-Neo-siHOXA5），陰性對照組（pRNAT-GFP-Neo-siNC），空白對照組（未作任何處理的K562/ADM）。本課題組前期設計并合成3條針對HOXA5的特異性有效siRNA序列，并篩選出對HOXA5抑制率最高的1條序列，正向：5'-TTGCGGTCGCTATCCAAATGG-3'，反向：5'-CCATT TGGATAGCGACCGCAA-3'[12-13]。根據此序列合成靶向抑制HOXA5的特異性真核表達載體pRNAT-GFPNeo-siHOXA5，并設計合成陰性對照載體pRNATGFP-Neo-siNC。轉染時調整細胞濃度為3×107個/ml接種于6孔板內，按LipofectamineTM2000說明書將脂質體與表達載體在無血清無抗生素培養基中混合配成轉染液轉染K562/ADM細胞。優化轉染條件，實驗獨立重復3次。收集上述各組細胞進行后續實驗。

1.3.2 CCK-8檢測 CCK-8實驗采用的ADM的干預濃度依次為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00及40.00 μg/ml。分別收集上述各組細胞，經不同濃度的ADM干預后調整細胞濃度為1×105個/ml，用微量移液器吸取100 μl細胞懸液加入96孔板中，同時設置對照組和空白調零組，每組設3個復孔，每孔再加10 μl的CCK-8溶液，放入CO2培養箱內作用2 h，在450 nm處用酶標儀測量各孔的OD值。求得均值計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率=（OD對照組-OD實驗組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。IC50=Ig-1[Xm-i（∑p-0.5）]。耐藥逆轉倍數=對照IC50/實驗IC50。

1.3.3 qRT-PCR檢測各組細胞中HOXA5及P38的mRNA表達 收集上述各組細胞，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉錄為cDNA，熒光定量PCR法擴增目的基因和內參照基因人GAPDH。HOXA5、p38及GAPDH引物擴增片段長度分別為140、130及262 bp，各引物的序列見表1。熒光定量PCR反應條件：95℃預變性60 s；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40個循環。數據運用公式RQ=2-△△Ct的方法進行分析，由此表示目的基因mRNA的相對表達水平。

表1 HOXA5、p38及GAPDH引物序列

1.3.4 Western blot檢測各組細胞中HOXA5、p38及p-p38的蛋白表達 分別收集上述各組細胞，按照全蛋白提取試劑盒說明書提取細胞全蛋白。BCA法測蛋白濃度，根據蛋白濃度取等量蛋白，加5×SDS上樣緩沖液煮沸5 min，進行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，經 TBST 充分漂洗（5 min，3次），HOXA5、p38及 p-p38多克隆抗體均按1∶1 000稀釋。4℃孵育過夜，充分漂洗后加山羊抗兔二抗按照1∶3 000稀釋，室溫27℃孵育1 h，ECL發光顯影。通過Gel-Pro annalyzer軟件分析圖像，以HOXA5、p38及p-p38蛋白條帶的灰度值與β-actin蛋白條帶的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.3.5 Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測 取對數生長期的K562/ADM，轉染24 h后，每組再分為ADM未干預組及加濃度為2.5 μg/ml的ADM干預組。用冷PBS將上述細胞組的細胞洗2次，調整細胞密度為3×105個 /ml將細胞重懸于 50 μl的 Binding Buffer，并加入5 μl 7-AAD，室溫27℃，避光染色5～15 min，然后分別加入450 μl Binding Buffer混勻，再加入1 μl Annexin V-PE，室溫27℃，避光染色5～15 min，在1 h內上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗獨立重復3次。

1.3.6 細胞周期的檢測 取對數生長期的K562/ADM，轉染24 h后用冷PBS將上述細胞組的細胞洗2次，調整細胞密度為1×106個/ml，取1 ml的單細胞懸液去除上清液，用70%的冷乙醇500 μl懸浮細胞4℃放置2 h或至過夜對細胞進行固定，PBS洗滌去乙醇。加入RNAase 100 μl 37℃水浴30 min。采用流式細胞儀進行DNA含量測定，結果用Multicycle software進行分析。實驗獨立重復3次。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計數資料用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡觀察轉染的各組細胞

用脂質體轉染K562/ADM細胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察各組細胞，因為轉入的重組質粒載體pRNA-GFP-Neo-siHOXA5和pRNAT-GFP-Neo-siNC帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因，因此實驗組和陰性對照組在熒光顯微鏡觀察下出現綠色熒光，而空白對照組未見熒光。見圖1。

2.2 ADM對各組細胞的抑制作用

ADM對各組細胞均有抑制作用，各組細胞的IC50比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=98.325，P=0.000），實驗組細胞的IC50與對照組比較降低（P＜0.05）。見表 2。

2.3 細胞中HOXA5、p38的mRNA表達情況

K562/ADM細胞中HOXA5的mRNA表達高于K562細胞（P＜0.05）。重組質粒轉染對數生長期的K562/ADM細胞后，比較各組細胞中HOXA5 mRNA的表達量，經方差分析，差異有統計學意義（F=122.282和172.900，均P=0.000），重組質粒能抑制K562/ADM細胞中HOXA5的mRNA表達（P＜0.05），同時p38的mRNA表達經方差分析，差異有統計學意義（F=152.817和34.227，均P=0.001），結果顯示，實驗組與對照組比較p38的mRNA表達增高（P＜0.05），而陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 3、4 和圖 2。

圖1 普通倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡下轉染的各組K562/ADM細胞

表2 ADM作用下各組細胞IC50的變化

2.4 各組細胞中HOXA5、p38及p-p38的表達情況

Western blot檢測發現，K562細胞中HOXA5蛋白的相對表達量低于K562/ADM細胞（P＜0.05）。穩定轉染后比較各組中HOXA5蛋白及p-p38的表達，經方差分析，差異有統計學意義（F=1722.480和115.433，均P=0.000），實驗組中HOXA5蛋白被抑制（P＜0.05）。實驗組中p-p38的蛋白相對表達量高于對照組（P＜0.05）。而陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結果表明，siRNA能特異性沉默K562/ADM中的HOXA5基因，并使p38激活為p-p38，但對p38的蛋白表達量差異無統計學意義（F=4.153，P=0.074）。見表5和圖3。

表3 HOXA5的mRNA表達 （±s）

表3 HOXA5的mRNA表達 （±s）

相對表達量（RQ=2-ΔΔCt）實驗組 0.31±0.12 0.22±0.09陰性對照組 1.35±0.10 0.99±0.04空白對照組 1.37±0.06 1.00 K562 0.58±0.11 0.42±0.11 F值 122.282 172.900 P值 0.000 0.000組別 HOXA5 mRNA（目的基因/內參照基因）

表4 p38的mRNA表達 （±s）

表4 p38的mRNA表達 （±s）

相對表達量（RQ=2-ΔΔCt）實驗組 1.17±0.07 3.26±0.59陰性對照組 0.38±0.06 1.06±0.29空白對照組 0.37±0.05 1.00 F值 152.817 34.227 P值 0.000 0.001組別 P38 mRNA（目的基因/內參照基因）

圖2 HOXA5、p38及GAPDH的擴增產物

2.5 siRNA特異性沉默HOXA5后K562/ADM細胞的凋亡情況

比較ADM未干預及ADM干預中各組細胞的凋亡，經方差分析，差異有統計學意義（F=17.606和423.492，P=0.003和0.000）。ADM未干預及干預中實驗組的凋亡率與對照組相比增高（P＜0.05）；ADM干預中各組細胞的凋亡率高于ADM未干預（P＜0.05），而ADM干預與ADM未干預中陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表6和圖4。

2.6 siRNA特異性沉默HOXA5后K562/ADM細胞的周期變化

各組細胞的G0/G1期和S期比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=115.783和70.549，均P=0.000）。與對照組比較，實驗組G0/G1期升高（P＜0.05），而 S期降低（P＜0.05）。陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。3組轉染細胞的G2/M期差異無統計學意義（F=0.568，P=0.594）。見表7和圖5。

表5 HOXA5、p38、p-p38的蛋白表達 （%，±s）

表5 HOXA5、p38、p-p38的蛋白表達 （%，±s）

圖3 各組細胞中HOXA5、p38及p-p38的蛋白表達（Western blot）

表6 ADM干預下各組細胞的凋亡率 （%，±s）

表6 ADM干預下各組細胞的凋亡率 （%，±s）

圖4 細胞的凋亡情況 （FCM法）

圖5 細胞周期的變化 （FCM法）

表7 沉默HOXA5后K562/ADM細胞周期的分布情況（%，±s）

表7 沉默HOXA5后K562/ADM細胞周期的分布情況（%，±s）

組別 G0/G1 G2/M S實驗組 46.85±2.01 10.82±2.62 42.93±1.68陰性對照組 25.52±2.29 12.21±2.51 62.60±2.26空白對照組 27.55±1.22 11.85±3.00 60.26±2.59 F值 115.783 0.568 70.549 P值 0.000 0.594 0.000

3 討論

哺乳動物的HOX基因在結構上分為A、B、C、D 4個簇，依次定位于7、17、12及2號染色體上，其按照線性順序進行表達并參與造血細胞的發育調控[14]。據報道，HOX基因在許多髓系白血病樣品中高表達，但是其表達的模式和相關監管機制并不清楚[15]。在MLL患者中能檢測到上調的HOXA基因，HOXA異常表達是造血細胞正常分化的一大障礙[16]。而HOXA5基因作為HOXA族中的一員，對白血病的發生、發展同樣具有重要影響。FULLER等[17]發現，過度表達HOXA5的K562細胞株紅細胞分化被抑制，抑制HOXA5表達有助于增高紅細胞祖細胞的分化及成熟。本實驗結果顯示，HOXA5基因在K562及K562/ADM細胞中高表達，且其在K562/ADM中的表達高于K562細胞，進一步證明HOXA5的過表達與白血病的發生、發展密切相關。

兒童慢性髓系白血病的5年生存率（5-year event-free survival，EFS）為44%[18]，復發和耐藥是影響其生存率的重要原因，因此，進一步研究髓系白血病的耐藥機制具有重要意義[19]。有研究表明，運用RNAi技術抑制HOXA7基因的表達在一定程度上可逆轉白血病細胞U937的多重耐藥[20]。據報道，通過降低和提高細胞中HOXA5的表達，觀察肺癌細胞對小細胞肺癌（SCLC）常用化療藥物敏感性的變化發現HOXA5可能參與SCLC耐藥性的產生[5]。而本實驗結果顯示K562/ADM細胞中HOXA5的表達增高，RNAi特異性沉默K562/ADM細胞中的HOXA5基因后，實驗組細胞對ADM的IC50較對照組的IC50降低2.55倍。結果提示，HOXA5基因與白血病細胞的耐藥性相關，沉默HOXA5基因能在一定程度上逆轉白血病細胞的耐藥性，與上述報道[20，5]的研究結果相似。

CUI等[10]應用TGF-β2抑制性抗體及p38抑制劑等干預胰腺癌細胞后發現下調HOXA10能降低TGF-β2及MMP-3的表達并抑制p38的活化，表明HOX基因與p38的活化相關。本實驗中有效沉默K562/ADM細胞中的HOXA5基因后，經檢測后發現實驗組細胞中的p38 mRNA及p-p38蛋白表達增高。結果提示，沉默HOXA5能增強p38mRNA的表達，并能激活p38使其磷酸化為p-p38，與CUI等[10]的研究結果相似。

結果顯示ADM未干預及ADM干預中，實驗組細胞的凋亡率較對照組增高；并且ADM干預組中各組細胞的凋亡率高于ADM未干預組。在細胞周期檢測中，實驗組與對照組比較G0/G1期細胞比例增加，S期細胞比例相應降低，說明抑制HOXA5的表達能減緩G0/G1期細胞進入增殖周期，減少細胞分裂增殖。以上結果提示沉默HOXA5基因后，能在一定程度上能增強細胞對ADM的敏感性，阻滯細胞的G0/G1期，減少細胞分裂增殖，從而促進細胞的凋亡。

綜上所述，HOXA5與K562/ADM細胞的耐藥性密切相關。沉默HOXA5在一定程度上能逆轉白血病的多重耐藥，其機制可能是通過增強p38的mRNA表達并使其激活為p-p38。RNAi技術沉默HOXA5基因后，激活p38MAPK信號轉導通路逆轉K562/ADM細胞的耐藥性可能成為耐藥白血病治療的新靶點。

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