血液系統條件性DNMT3B基因敲除小鼠的構建及鑒定*

李福興，胡超，何薇，喬曉紅，謝曉恬

（1.同濟大學附屬同濟醫院 兒科，上海 200065；2.復旦大學附屬中山醫院泌尿外科，上海 200032）

抑癌基因失活可導致腫瘤的發生，而啟動子區高甲基化是導致抑癌基因沉默失活的常見機制之一，該現象廣泛地存在于多種惡性腫瘤中[1]。DNA甲基化是表觀遺傳學中一種最為重要的修飾，是通過DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）來催化和維持。DNMTs包括 DNMT1，DNMT2，DNMT3A，DNMT3B，后2個在哺乳動物DNA甲基化中起主要催化作用[2]。目前研究發現，DNMT3B在部分MDS及急性髓系白血病中呈高表達水平，且高表達患者生存期較短，化療療效不佳，預后不良，提示DNMT3B在血液腫瘤疾病發生、發展起重要作用[3-6]。通過基因敲除是研究基因功能的主要手段之一，目前國內尚無在血液系統條件性敲出DNMT3B基因小鼠模型的報道，國外僅有利用Cre/loxP系統在細胞水平敲出DNMT3B基因的研究[7]，也有可以在腸道組織敲除DNMT3B小鼠模型相關研究[8]，尚無可以條件性在血液系統敲出DNMT3B基因小鼠模型的報道。本課題組利用引進的DNMT3Bflox/flox小鼠，與Mx1-Cre小鼠交配，成功構建可以在血液系統條件性敲除DNMT3B基因的小鼠，并進行敲除后鑒定，為研究DNMT3B在血液腫瘤中的作用提供動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

DNMT3Bflox/flox小鼠 [從 Fan Guoping教授（David Geffen School of Medicine，UCLA）獲得 ]，Mx1-Cre小鼠（由伊利諾伊大學芝加哥校區血液腫瘤研究實驗室保存繁育），均為C57BL/6背景。所有動物飼養繁殖均在伊利諾伊大學芝加哥校區實驗動物中心完成。

1.2 小鼠飼養和繁殖

按照SPF級動物飼養標準進行飼養，環境溫度控制在20～25℃，濕度控制在40%～70%，小鼠飼料、墊料和飲水均經過高溫高壓滅菌處理，墊料1周更換1次。采用1只雄鼠和2只雌鼠同居的方式進行繁殖。母鼠孕期為19～21 d，哺乳期為20～22 d。

1.3 方法

1.3.1 小鼠構建策略與流程 DNMT3Bflox/flox小鼠，是以DNMT3B基因的16～19號外顯子作為靶基因，在其兩端插入loxP位點（見圖1A），與表達Cre酶的Mx1-Cre工具鼠（見圖1B）交配后獲得DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+，通過注射pI-pC注射誘導Cre重組酶表達，切除2個LoxP位點間的序列，從而實現靶基因的敲除。

1.3.2 構建流程 DNMT3Bflox/flox小鼠與Mx1-Cre+小鼠交配后產生DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+及DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-2種子代，再用DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-與DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+雜交產生子代，最后通過PCR反應鑒定其基因型（見圖1C）。

圖1 DNMT3B敲除小鼠模型構建流程

1.3.3 小鼠基因型鑒定 剪取4周齡小鼠尾尖2～5 mm，置于1.5 ml Eppendorf管中，每管加入鼠尾裂解緩沖液（direct PCR lysis reagent，Viagen Biotech Inc）100 μl和 蛋 白 酶 K（proteinase K，Sigma-Aldrich）5 μl，55℃震蕩裂解過夜；然后85℃，45 min滅活蛋白酶K；室溫，12 000 r/min離心，5 min，取上清做模板可用于PCR分析。使用Sigma公司合成的引物進行聚合酶鏈反應（PCR）。見表1。

反應體系（10 μl）：10×Titanium Taq Buffer 1 μl，模板 DNA 1 μl，正反向引物各 0.1 μl，50×Titanium Taq Polymerase 0.2 μl，4 μmol/L dNTP 0.5 μl，雙蒸水補足至10 μl。反應條件為95℃預變性1 min；95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸30 s，33個循環；最后72℃延伸7 min，置入4℃保存備用，取PCR反應終產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，根據擴增條帶確定小鼠子代基因型。

表1 基因型鑒定的引物

使用Floxed引物擴增，凡是能擴增出2條帶（270和406 bp）者均為DNMT3Bflox/+，而只能擴增出1條406 bp條帶者基因型必為DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+或者DNMT3Bflox/floxMx1-Cre-；再以Cre通用異物擴增，凡是可以擴增出301 bp條帶者為DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+，即可以用于DNMT3B敲除的小鼠，見表2。

表2 基因型對應電泳條帶

1.3.4 轉基因小鼠DNMT3B敲除效能鑒定 由于floxed小鼠在DNMT3B基因的15和16，19和20號外顯子中間各插入1個LoxP位點，設計敲除后鑒定引物primer F’，位于15號外顯子，如果成功敲除，將可以擴增出500 bp左右條帶。對DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠，通過隔天腹腔注射聚肌胞苷酸（pI-pC；GE Healthcare）1次，體重10 μg/g，共5次，誘導DNMT3B基因的丟失。pI-pC腹腔注射完成后，第7天處死小鼠取骨髓細胞，使用DNA提取試劑盒（Puregene Blood Core KitB，QIAGEN）按說明書提取DNA，同時使用3條引物primer F，primer F’，primer R按genotyping體系和條件行PCR證實DNMT3B的敲除。

2 結果

2.1 DNMT3Bflox/flox Mx1-Cre+小鼠鑒定

通過DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+和DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-交配，共產出小鼠13只，分兩步分別進行DNMT3Bflox/flox和Mx1-Cre基因型鑒定。

2.1.1 DNMT3Bflox/flox基因型鑒定 DNMT3Bflox/+小鼠自交所生子代DNMT3Bflox/flox、DNMT3Bflox/+、DNMT3B+/+的基因型鑒定結果，見圖2：僅可以擴增出270 bp條帶的為野生型（如2號和10號），可以同時擴增儲270和406 bp的為雜合子（如1，3，6，11，13號），而僅可以擴增出406 bp條帶者為DNMT3Bflox/flox，需要的突變純合子（如4，5，7，8，9，12號）。

圖2 DNMT3Bflox/flox基因型PCR鑒定結果

2.1.2 Mx1-Cre基因型鑒定 Mx1-Cre+及Mx1-Cre-小鼠交配僅可以產出Mx1-Cre+和Mx1-Cre-兩種子代，其中基因型為Mx1-Cre+的子代可以擴增出301 bp條帶（如9和12號），而基因型為Mx1-Cre-的子代無法擴增出條帶（如1-8號，10號和13號），在獲得的13只子代小鼠中，只有9號和12號攜帶Mx1-Cre基因。見圖3。

圖3 Mx1-Cre基因型PCR鑒定結果

2.1.3 DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+個體獲得 綜合分析DNMT3Bflox/flox基因型和Mx1-Cre基因型鑒定結果，確認9號和12號子鼠基因型為DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+，是可以用于敲除DNMT3B的工具鼠。

2.2 Dnmt3B敲除鑒定

對DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠，隔天注射5次pI-pC后，取鼠尾組織行PCR進行基因型鑒定，由于可以敲除DNMT3B基因，故能擴增出500 bp的片段，用作實驗組對象。而DNMT3Bflox/floxMx1-Cre-小鼠無法敲除DNMT3B基因，只能擴增出406 bp的片段，可用作對照組。見圖4。

圖4 DNMT3B敲除后PCR鑒定結果

3 討論

在哺乳動物基因組中，CpG島甲基化是最常見的表觀遺傳學修飾，不僅對個體正常發育起重要作用，還可以影響基因表達、染色體結構和穩定性[9]。甲基化調控需要DNMTs的參與，其中DNMT3A和DNMT3B負責從頭甲基化，影響DNA的甲基化水平并調節基因表達[10]。R OBERTSON等研究發現，惡性腫瘤患者DNMT3A、DNMT1及DNMT3B表達上調，且DNMT3B的表達水平升高最為顯著[11]，提示DNMT3B可能在惡性腫瘤發病中起重要作用。隨著研究的深入發現，DNMT3B基因高表達與膀胱癌，胃腸道惡性腫瘤，乳腺癌、肝癌及白血病等多種惡性腫瘤發生、發展關系密切[12-15]，目前認為，DNMT3B可以導致抑癌基因啟動子CpG島高甲基化，導致基因表達沉默，從而導致腫瘤的發生[16-17]。有研究提示，DNMT3B在myc誘發的淋巴瘤和MLL-AF9誘發的AML中表現為抑制腫瘤作用，提示其抑癌基因屬性[18]，然而亦有研究顯示在AML患者中，DNMT3B高表達與不良預后有關[19]，提示原癌基因屬性，故DNMT3B在血液腫瘤中的作用和機制有待進一步研究。

構建基因敲除小鼠模型，在全部組織或者特定組織中使某基因功能缺失，是闡明該基因功能最直接有效的手段之一。Cre/LoxP重組酶系統是目前用于條件性基因敲除中最常用的系統工具之一。LoxP序列來源于噬菌體P1，而Cre酶是來源于噬菌體P1的一種蛋白。LoxP序列中的特殊回文結構可以被Cre酶特異性識別結合并催化2個LoxP序列之間的片段發生同源重組，進而實現對該片段的基因敲除。如果將Cre重組酶cDNA通過基因工程的手段置于組織或細胞特異性啟動子之下，可以實現在特定組織/細胞特異性表達Cre，獲得Cre工具小鼠跟Flox小鼠交配之后，可以得到可以在特定組織細胞中進行基因敲除的小鼠[20]。

本研究為構建DNMT3B基因條件性敲除小鼠，首先從美國實驗室引進DNMT3Bflox/flox小鼠，該小鼠在DNMT3B基因的15和16，19和20號外顯子中間各插入1個LoxP位點[21]。通過與血液系統特異表達Cre酶的Mx1-Cre小鼠雜交，獲得DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠，用pI-pC誘導Cre酶表達，可以在血液系統敲除DNMT3B核心序列，使得靶基因不能正常轉錄表達。DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠模型的構建為研究DNMT3B在正常造血調控及血液腫瘤中的作用機制提供合適的工具。基于Cre/LoxP系統，開發構建其他組織系統特異性CRE表達小鼠，可以通過條件敲除DNMT3B研究其在多種腫瘤中的作用機制。

志謝：感謝UCLA范國平教授慷慨提供DNMT3Bflox/flox小鼠，感謝伊利諾伊大學芝加哥分校錢志堅教授提供Mx1-cre小鼠及實驗指導，感謝黎力平博士對實驗操作技術指導。

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