血管緊張素Ⅱ2型受體活化在缺血再灌損傷中的神經保護作用及機制研究*

劉遠新，張玉蓉，苗常青

（1.西安體育學院健康科學系，陜西 西安 710068；西安交通大學第一附屬醫院2.神經內科，3.急診科，陜西 西安 710061）

血管緊張素Ⅱ2型（angiotensin type 2，AT2）受體活化后對缺血腦卒中動物具有神經保護作用[1]。刺激AT2受體可減少小鼠永久性或暫時性大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后梗死面積；還可減少神經細胞凋亡并降低小鼠死亡率[2]。最近有研究指出，AT2受體激動劑C21可使MCAO大鼠缺血半球神經保護細胞因子白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）表達增加[3]。但是IL-10增加與大鼠神經功能改善的關系仍不明確。IL-10是一種抗炎細胞因子，通過激活JAK1-STAT3信號通路發揮作用[4]。研究已證實，IL-10在體內外具有神經保護作用[5-6]。AT2受體激動劑，CGP-42112，不是C21，對葡萄糖剝奪大腦皮質神經元具有保護作用[7]。因而，本研究主要評估AT2受體激動劑CGP-42112在MCAO大鼠以及氧糖剝奪（oxygen deprivation，OGD）原代神經元模型中的神經保護作用，及其與抗炎細胞因子IL-10的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 雄性Wistar大鼠，體重280～340 g，購于西安體育學院。實驗大鼠隨機分為Sham組和MCAO組，MCAO組大鼠進一步分為：MCAO組、CGP42112+MCAO組、CGP42112+IL-10中和抗體+MCAO組及IL-10中和抗體+MCAO組，每組各5只大鼠。

1.1.2 實驗儀器和試劑 CGP42112、PD123319、TTC染料、MTT和DMSO（美國Sigma公司），TNF-α ELISA試劑盒（廣州銳博生物科技公司），DMEM培養基（美國Gibco公司），IL-10中和抗體（上海安研商貿有限公司），剪切Caspase-3抗體（美國Santa公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦缺血再灌模型的復制 10%水合氯醛麻醉（150～200 mg/kg），然后進頸部手術。顯微鏡下分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈。然后用縫合線結扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠心端，用針頭在頸外動脈遠端動脈壁上扎1個小口，將線栓從頸外動脈孔插入頸總動脈，通過頸內動脈最后到達大腦中動脈，用縫合線固定線栓，MCAO后3 h拔出線栓，再灌注21 h。模型復制成功的標志是大鼠麻醉清醒后出現手術側肢體癱瘓，站立不穩。手術成功率約為80%。Sham組大鼠僅分離頸部血管，大腦中動脈不插入栓線，其他手術操作步驟同MCAO組。CGP42112（1 mg/kg）和IL-10中和抗體（0.1 mg/kg）均在大鼠再灌時腹腔注射。

1.2.2 腦梗死體積評估 MCAO手術后24 h，將大鼠麻醉后取腦，置入-20℃冰箱冷凍15 min后，行冠狀切片，厚度為1.5 mm。將切好的腦片迅速放入準備 好 的 1% 2，3，5- 三 苯 基 氯 化 四 氮 唑（2，3，5-three，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）磷酸鹽緩沖液中，在37℃水浴中避光孵育10 min。腦梗死區域不染色（灰白色），而正常腦組織染為深紅色。依據相關文獻報道[8]方法計算MCAO后腦梗死體積。

1.2.3 行為學評估 Bederson評分：MCAO手術后24 h，放在空曠的地方進行評分。評分范圍在1～3分之間。1分為大鼠提尾懸空時前肢彎曲；2分為側推時阻力降低；3分為向癱瘓側轉圈。

Beam walk評分測試MCAO手術后24 h大鼠在橫梁上的平衡。大鼠放在橫梁上1min，評分范圍在0～6分之間。0分：以穩定的姿勢在平衡木上；1分：抓住平衡木側面；2分：抱住平衡木，1肢跌下；3分：抱住平衡木，2肢跌下；4分：40～60 s從平衡木跌下；5分：20～40 s從平衡木跌下；6分：20 s內從從平衡木跌下。

1.2.4 ELISA分析 尾靜脈抽取MCAO大鼠血液，通過ELISA試劑盒規定的步驟檢測血液中TNF-α濃度。1.2.5 原代神經元分離和培養 從妊娠Wistar大鼠17 d胚胎中分離大腦皮層。用冷Hank液沖洗，用剪刀剪碎，并用吸管吹打，然后加入胰蛋白酶消化15 min，加入DEME培養液，將細胞懸液加入新試管中，吸管吹打，靜放10 min，重復2、3次。用篩網過濾細胞懸液，加入DEEM培養基，在培養箱中培養10～12 d后進行相關檢測。

1.2.6 氧糖剝奪/復氧（oxygen deprivation/reoxygenation，OGD/R） 為模擬體內缺血/再灌注，原代神經元進行OGD 3、6或9 h后復氧6 h。對細胞OGD，把常規細胞培養基換成無糖培養基，后孵育在缺氧培養箱中培養（94%氮氣N2，5%二氧化碳CO2，小于1%氧氣O2）。復氧即把無糖培養基換成常規培養基，常規培養箱中培養（94%空氣，5% CO2）。在OGD實驗中，神經元OGD開始前采用不同濃度CGP42112處理。在OGD/R實驗中，細胞復氧時采用CGP4211（10、100和 1 000 nmol/L）、AT2受體拮抗劑 PD123319（1 μmol/L）或IL-10中和抗體（1 μg/ml）處理。

1.2.7 MTT分析 實驗結束時，96孔培養板加入MTT溶液（0.5 mg/ml），反應4 h。去除溶液，加入DMSO融解結晶物，孵育5 min，使用酶標儀在540 nm處測量吸光值。

1.2.8 Western blot分析 提取原代神經元總蛋白，取20 μg進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜上。用兔抗剪切Caspase-3多克隆抗體（1∶1 000）和鼠抗β-actin多克隆抗體（1∶2 000）4℃孵育3 h。用PBS-T稀釋山羊抗兔和山羊抗鼠的Ⅱ抗（1∶25 000），室溫孵育1 h。洗膜后用化學發光掃描系統檢測并攝片，以β-actin為內參，應用圖像分析軟件Quantity one進行吸光度積分值分析。

1.3 統計學方法

數據處理采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較用Tukey HSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-10對大鼠體內CGP42112介導的神經保護作用的影響

經方差分析顯示，各組間梗死體積比較，差異有統計學意義（F=6.081，P=0.025），與MCAO組大鼠比較，CGP42112腹腔注射可減少MCAO大鼠梗死體積（P=0.032）；而IL-10中和抗體可消除CGP42112誘導的神經保護作用（見圖1）。IL-10可能參與CGP42112介導的神經保護作用。經方差分析也顯示，各組間Bederson（F=12.142，P=0.013）和Beam walk評分（F=9.749，P=0.019）差異有統計學意義，其中CGP42112處理可改善MCAO手術24 h后 大 鼠Bederson（P=0.017） 和 Beam walk評 分（P=0.026），而IL-10中和抗體可阻止神經功能恢復（見圖2）。各組間血液TNF-α濃度差異也有統計學意義（F=20.537，P=0.006），與Sham組大鼠比較，MCAO組大鼠血液中炎癥細胞因子TNF-α水平增加。而CGP42112腹腔注射可降低MCAO大鼠血液中TNF-α濃度（P=0.012），IL-10中和抗體也可消除CGP42112的抗炎作用（見圖3）。

2.2 CGP42112在體外實驗中發揮直接神經保護作用

實驗證實，原代神經元OGD 6 h，然后復氧6 h提供最合適的細胞死亡數量。MTT分析顯示各組間比較，差異有統計學意義（F=14.537，P=0.018）；與Sham組比較，不同濃度CGP42112（10、100和1 000 nmol/L）處理均可使OGD/R神經元活力增加（P=0.013、0.009及 0.008）（見圖 4）。Western blot顯示不同組細胞剪切Caspase-3表達差異有統計學意義（F=10.058，P=0.027），其中CGP42112具有抗凋亡作用，CGP42112抗凋亡作用可被AT2受體拮抗劑PD123319抑制，但是IL-10中和抗體對該效應無影響（見圖5）。結果表明，CGP42112在體外發揮神經保護作用，且與IL-10無關。

圖1 典型TTC染色腦片及定量不同組間梗死體積

圖2 各組MCAO手術24 h行為學評分

圖3 各組大鼠血液TNF-α濃度 （ELISA）

圖4 各組細胞的活力 （MTT）

圖5 各組細胞剪切Caspase-3表達 （Western blot）

3 討論

近年研究已證實，炎癥反應在腦缺血/再灌注損傷中發揮關鍵作用。中樞神經系統中有許多組織和細胞可產生炎癥細胞因子，比如IL-10和TNF-Α等[9]。該細胞因子在腦缺血/再灌注引起的炎癥損傷過程中廣泛參與，在神經元損傷及修復過程中也發揮重要作用。AT2受體廣泛分布于中樞神經系統中，研究已經證實，AT2受體可以促進神經細胞的分化和再生，從而具有神經保護功能[10]，但是其確切作用機制仍不明確。該研究證實，AT2受體激動劑CGP42112可能通過IL-10在大鼠暫時性MCAO后發揮神經保護和抗炎作用。此外，目前結果也顯示，CGP42112在原代神經元OGD/R損傷中直接發揮神經保護作用，與IL-10調節無關。

最近有報道指出，AT2受體激動劑在腎臟炎癥和心肌缺血模型通過刺激活AT2受體發揮保護作用，而且IL-10也在其中發揮作用[11]。黃焱平等人研究發現，CGP42112+缺血/再灌模型組腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α表達小于Sham組，而IL-4和IL-10表達高于Sham組；PD123319+缺血/再灌模型組腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α表達高于Sham組，同時IL-4和IL-10表達低于Sham組[12]。在本研究主要明確是否IL-10上調與CGP42112的神經保護作用相關。研究結果顯示，IL-10中和抗體可消除CGP42112在腦缺血/再灌大鼠中介導的神經保護和抗炎作用。另外，其他試劑也可通過介導IL-10上調從而發揮神經保護作用。例如，內源性肽，黑皮膚素已被證明通過誘導IL-10上調從而減輕腦缺血和創傷性腦損傷后的組織損傷[13]。CGP42112可以刺激不同細胞產生IL-10。CGP42112很難通過完整血腦屏障滲透到大腦中。然而，短暫性MCAO可破壞血腦屏障的完整性[14]。因此，CGP42112可以滲透到缺血腦組織，并刺激未損傷的神經元產生IL-10。

CGP421121也可能通過全身免疫細胞產生IL-10。IL-10可通過調節T淋巴細胞參與全身免疫細胞的神經保護作用[15]。在本研究中，阻斷IL-10不能完全逆轉MCAO 24 h后大鼠的神經功能改善，提示其他介質也可能參與CGP421121介導的神經保護。

既往研究顯示，AT2受體激動劑在體外無神經保護作用[7]。但是本研究中，CGP42112對OGD/R原代神經元具有神經保護作用，表現為神經元存活率增加和細胞凋亡減少。差異可能是由于體外缺血/再灌模型不一樣所致。LEE在研究中僅僅采用葡萄糖剝奪，而該研究使用氧糖剝奪并聯合復氧。但是CGP42112直接神經保護作用的機制尚待闡明。最近報告指出，AT2受體在神經元線粒體上表達。氧化應激可誘導神經元AT2受體表達增加，從而降低線粒體呼吸[16]。上述結果提示，AT2受體可能通過調節線粒體呼吸發揮神經保護作用。

總之，研究結果表明，IL-10參與AT2受體激動劑CGP42112介導的體內神經保護作用。此外，CGP42112C21對體外原代神經元具有直接的神經保護作用。

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