閉合性腎損傷早期腎臟組織中轉化生長因子β1的表達及意義

楊 琦，王養民，常德輝，張 斌，康菲斐

(解放軍蘭州總醫院，甘肅 蘭州 730050)

腎損傷多見于男性青壯年，在所有外傷中占1%～5%，在腹部損傷中占8%～10%，在泌尿系損傷中最為常見[1]，其中以閉合性腎損傷多見，常伴有其他臟器合并傷，嚴重者可威脅患者生命。腎損傷經保守或微創介入治療后，部分血管再通，但存在缺血再灌注后損傷，是創傷領域亟待解決和研究的課題。腎臟組織中細胞因子的表達及相關治療藥物的研究日益受到人們的關注。轉化生長因子β1(TGF-β1)可通過細胞表面復雜的信號轉導途徑發揮多種生物學功能，在創傷愈合、胚胎發育、細胞外基質(ECM)形成、骨改建、免疫調節、神經系統的發育、器官纖維化以及腫瘤的發生、發展等過程中發揮重要作用[2]。本研究觀察了閉合性腎損傷新西蘭兔腎臟組織的組織學表現及腎臟組織中TGF-β1的表達情況，旨在探討腎臟組織中TGF-β1表達情況與早期閉合性腎損傷的關系，為閉合性腎損傷的治療提供新的理論依據。

1 實驗資料

1.1 實驗動物 健康新西蘭兔36只，雌雄不限，兔齡12～16周，體質量1.81～2.60(2.11±0.24)kg，由我院動物實驗科提供。將36只新西蘭兔隨機分為正常組4只和創傷組32只，創傷組再根據不同撞擊高度(30 cm、40 cm、50 cm、60 cm)隨機分為4個亞組，每組8只。

1.2 試劑 免疫組織化學試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。BA0290即用型Rabbit anti-TGF-β16 mL；SA1022即用型SABC免疫組化染色試劑盒：5%BSA封閉液12 mL，山羊抗兔IgG親和純化抗體12 mL，SABC 12 mL；AR1022 DAB顯色試劑盒：顯色劑A(DAB×20倍濃縮液)3 mL，顯色劑B(H2O2×20倍濃縮液)3 mL，顯色劑C(TBS緩沖液×20倍濃縮液)3 mL。

1.3 儀器與設備 小型生物撞擊器，參照BIM-Ⅳ型生物撞擊機[3](第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所研制)自制，主要由200 g砝碼、聯塑管、支撐架及動物實驗臺等組成。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型建立 創傷組32只進行造模，用3%戊巴比妥鈉注射液(1 mL/kg)經實驗兔耳緣靜脈注射，麻醉滿意后用脫毛劑脫去腎區體毛，將其俯臥位固定于動物實驗臺上，季肋部墊長方形硬物，根據不同分組用200 g砝碼(直徑3.0 cm)分別從30 cm、40 cm、50 cm、60 cm高處(以相應長度的聯塑管作為軌道，管道內徑3.5 cm)自由落體垂直撞擊實驗兔左、右側腎區，建立不同程度的閉合性腎損傷模型，最后62個腎臟造模成功(有2個腎臟病理檢查未見明確腎損傷)，損傷分級Ⅰ級8個、Ⅱ級11個、Ⅲ級15個、Ⅳ級21個、Ⅴ級7個。

1.4.2 腎臟組織的組織學觀察 取兔腎臟組織標本，HE染色，由同一病理醫師采用盲法在Olympus光學顯微鏡下觀察腎臟組織的組織學表現，病變嚴重處用高倍鏡觀察。

1.4.3 腎臟組織中TGF-β1表達觀察 兔腎臟組織標本進行免疫組織化學染色，以大鼠肝臟標本石蠟切片作為TGF-β1陽性表達對照，以PBS液代替一抗染色作為陰性對照。TGF-β1陽性表達為細胞質呈棕褐色顆粒著色，每張切片隨機選取5個高倍視野計數陽性細胞數，取其平均值作為每張切片的最后判定結果，并分析創傷組TGF-β1表達情況與腎損傷分級的關系。結果判定標準：組織完全不著色或陽性細胞數≤25%為陰性(-)，陽性細胞數26%～50%為弱陽性(+)，陽性細胞數51%～75%為中等陽性()，陽性細胞數>75%為強陽性()。

1.5 統計學方法 所有數據采用SPSS 16.0軟件包進行分析。等級資料的兩個獨立樣本比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多個獨立樣本比較采用Kruskal-WallisH檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 腎臟組織的組織學表現 正常組腎包膜完整，腎小球、腎小管結構正常。創傷組腎包膜下可見大量紅細胞聚集，部分腎包膜破裂；腎內可見片狀出血灶并伴炎細胞滲出，腎小球及腎小管內可見紅細胞增多；多數腎小管上皮細胞扁平，胞漿疏松，部分腎小管上皮細胞呈空泡樣改變，刷狀緣損傷或脫落；多數腎小管腔內可見淡紅色絮狀物質；以上病變均隨著腎損傷分級的升高而加重。

2.2 腎臟組織中TGF-β1表達情況 正常組腎臟組織中可見少數腎小管上皮細胞胞漿呈淡黃色顆粒著色，TGF-β1陽性表達率為25.00%(2/8)；創傷組腎臟組織中可見腎小管上皮細胞胞漿呈棕褐色顆粒著色，TGF-β1陽性表達率為91.94%(57/62)。創傷組腎臟組織中TGF-β1陽性表達率明顯高于正常組(Z=3.84，P<0.05)。見表1。

表1 2組腎臟組織中TGF-β1表達情況 個(%)

2.3 創傷組腎臟組織中TGF-β1表達情況與腎損傷分級的關系 腎臟組織中TGF-β1陽性表達率隨著腎損傷程度的加重而升高(H=27.92，P<0.05)。見表2。

3 討 論

Shiozuru等[4]在葉酸誘導的小鼠急性腎損傷(AKI)模型中觀察到腎遠端小管和近端小管損傷顯著加重，腎小管擴張與萎縮同時存在，而在細針穿刺引起的創傷性腎損傷模型中可見穿刺區域出現管狀壞死斑和纖維化進展。付剛等[5]在新西蘭兔閉合性腎損傷模型大體標本中見腎包膜破裂、腎包膜下血腫、腎實質挫裂傷并血腫形成，光鏡下見腎細胞發生不同程度損傷，腎毛細血管充血，腎小管內可見紅細胞管型和蛋白管型。本實驗于創傷組腎臟組織中可見近被膜層、腎小球密集區近皮質側、腎小球密集區近髓質側的腎小管上皮細胞病變主要為空泡變性，其中以近被膜層腎小管上皮細胞病變最為顯著，近髓質區近曲小管上皮細胞病變主要為顆粒變性，病變較輕，遠曲小管及直小管病變最輕，同時以上各處病變隨著腎損傷分級的升高而加重，考慮發生上述變化的原因可能與腎動脈主干由腎門處逐漸分支至近被膜層毛細血管網呈樹枝狀分布的特點以及損傷發生后腎臟血流的重新分布密切相關。

表2 創傷組腎臟組織中TGF-β1表達情況與腎損傷分級的關系 個(%)

TGF-β1是由2個結構相同或相近、分子量分別為12.5 kD的亞單位借二硫鍵連接形成的雙體，是一種多功能細胞因子，在細胞增殖、分化、創面愈合和腫瘤生成轉移等過程中均發揮重要調控作用[6]。起初對TGF-β1的生物學功能研究主要在炎癥、組織修復和胚胎發育等方面，近年來發現TGF-β1對細胞的生長、分化和免疫功能都具有重要的調節作用[7-9]。一般TGF-β1對間充質起源的細胞起刺激作用，而對上皮或神經外胚層來源的細胞則起著抑制作用。近年研究表明，TGF-β1可通過多種信號通路誘導上皮間質轉化(EMT)，包括Smad通路和非Smad通路，而Smad信號通路是TGF-β1誘導EMT的主要途徑，TGF-β1與其Ⅰ、Ⅱ型受體相結合引起Smad 2和Smad 3磷酸化，磷酸化的Smads 2/3與細胞質內的Smad 4配對并轉移至細胞核內，通過與特定基因調節區域結合調控靶基因的轉錄[10-11]。

TGF-β1是目前公認的最為重要的促進腎間質纖維化的細胞因子之一，而腎間質纖維化又是各種腎臟疾病最終進展到腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎，涉及多種細胞、細胞因子及ECM的相互作用，TGF-β1在這一復雜過程中發揮關鍵作用，可促進成纖維細胞分泌膠原蛋白，引起腎間質ECM成分沉積，導致腎間質纖維化[12-13]。本實驗中創傷組腎臟組織中TGF-β1陽性表達率明顯高于正常組，且TGF-β1陽性表達率隨著腎損傷程度的加重而升高。提示在閉合性腎損傷發生后，TGF-β1作為一種損傷因子，對腎臟組織的損傷修復具有重要影響，有望為臨床上尋找減輕腎損傷后組織和細胞損害的有效干預手段提供新的理論依據。

[1] Bryk DJ,Zhao LC. Guideline of guidelines:A review of urologic trauma guidelines[J]. BJU Int,2016,117(2):226-234

[2] Pan B,Liu G,Jiang Z,et al. Regulation of renal fibrosis by macrophage polarization[J]. Cell Physiol Biochem,2015,35(3):1062-1069

[3] 麻曉林,楊志煥,王正國,等. 實驗性肝臟撞擊傷的生物力學機制研究[J]. 創傷外科雜志,2007,9(4):351-354

[4] Shiozuru D,Ichii O,Kimura J,et al. MRL/MpJ mice show unique pathological features after experimental kidney injury[J]. Histol Histopathol,2016,31(2):189-204

[5] 付剛,那桂萍,徐亞明,等. B-flow能量模式對兔閉合性腎損傷后血流灌注的動態觀察[J]. 華南國防醫學雜志,2013,27(11):777-779

[6] 王秋實,李平. TGF-β1受體1和2在TGF-β1調節細胞增殖中的作用[J]. 中國生物化學與分子生物學報,2017,33(2):122-127

[7] Ma FY,Tesch GH,Ozols E,et al. TGF-β1-activated kinase-1 regulates inflammation and fibrosis in the obstructed kidney[J]. Am J Physiol Renal Physiol,2011,300(6):1410-1420

[8] Perera M,Tsang CS,Distel RJ,et al. TGF-beta1 interactome:metastasis and beyond[J]. Cancer Genomics Proteomics,2010,7(4):217-229

[9] Hadaschik EN,Enk AH. TGF-β1-induced regulatory T cells[J]. Hum Immunol,2015,76(8):561-564

[10] 危志強,涂衛平,房向東. 促腎小管上皮細胞轉分化誘導劑的研究進展[J]. 中國現代醫學雜志,2012,22(2):59-64

[11] Lan HY,Chung AC. TGF-β/Smad signaling in kidney disease[J]. Semin Nephrol,2012,32(3):236-243

[12] Shen B,Liu X,Fan Y,et al. Macrophages regulate renal fibrosis through modulating TGFβ superfamily signaling[J]. Inflammation,2014,37(6):2076-2084

[13] Meng XM,Nikolic-Paterson DJ,Lan HY. TGF-β:the master regulator of fibrosis[J]. Nat Rev Nephrol,2016,12(6):325-338