BCG感染小鼠模型中產IL-35單核細胞的檢測及其意義①

陳 晨 張俊愛 劉雨晴 徐 歡 羅厚龍 李瑞曦 鄭碧英 徐軍發(fā)

(廣東醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學研究所，東莞 523808)

結核病(Tuberculosis,TB)是主要由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)通過空氣經呼吸道傳播后感染而引起的傳染性疾病，可嚴重危害人類健康[1]，據(jù)WHO發(fā)布數(shù)據(jù)顯示2015年全球約140萬人死于結核病，我國是結核病高負擔國家[2]。結核病患者多潛伏感染，呈慢性遷延又易復發(fā)，現(xiàn)有疫苗接種效果欠佳以及耐藥性結核菌逃逸機體抗結核免疫機制尚未明確[3-5]。 單核巨噬細胞/巨噬細胞是MTB在體內的主要宿主,也是作為機體抗結核免疫的第一道防線[6],單核細胞極具異質性，可分泌高水平的炎癥因子，如TNF-α和IL-12等，促進抗原誘導的T細胞活化[7-9]。結核菌感染后，患者外周血單核細胞可以快速進入組織器官中分化為巨噬細胞和樹突狀細胞并在炎癥周圍抑制或清除體內的MTB[10]，活化的單核細胞可產生負向免疫調節(jié)因子IL-35[11]，白介素35(Interleukin-35，IL-35)是一種新發(fā)現(xiàn)的起負向調節(jié)作用的細胞因子[12-14]，主要由P35和EBI3兩個亞基組成，屬于IL-12家族成員[15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)活動性肺結核患者外周血IL-35水平顯著升高，產IL-35的T細胞增高，且BCG刺激可致患者IL-35表達增加，提示IL-35參與結核免疫應答的調節(jié)，但有關產IL-35單核細胞在抗結核免疫中的作用未見報道。本實驗選取易建立MTB感染且臟器荷菌量相對較高的C57BL/6小鼠[16]，尾靜脈注射卡介苗(BCG)建立結核菌感染動物模型,于不同時間點檢測外周血和肺組織中產IL-35單核細胞數(shù)，分析其于肺組織中載菌量的相關性，探討產IL-35單核細胞在結核免疫防衛(wèi)中作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1主要試劑和儀器 流式抗體為EBI3-APC(R&D,IC18341A),P35-FITC(R&D,IC2191F),小鼠外周血單個核細胞分離液、小鼠組織分離液購自TBDsciences公司，F(xiàn)ACS-VerseⅡ流式細胞儀為BD公司產品，其他器材包括倒置熒光顯微鏡、生物安全柜、切片機、BCG(美國University of Illinois at Chicago陳維政教授提供)、羅氏培養(yǎng)基(貝索)、抗酸染色試劑盒(貝索)、HE染色試劑盒等。

1.1.2實驗動物 無特定病原體(SPF)級的C57BL/6J雌性小鼠，6～8周齡，體重16～18 g，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，具廣東省實驗動物質量合格證明[許可證號SCXK(粵)2016-0041]。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠模型制備 將C57BL/6J小鼠平均分為BCG感染實驗組和生理鹽水對照組，實驗組以每只2×106CFU/200 μl劑量經尾靜脈途徑感染BCG,對照組注射200 μl生理鹽水，小鼠感染后分別在2、4、8周摘眼球取血、解剖獲取肺臟，進行組織荷菌量、病理及細胞因子流式分析，每個時間點各取6～7只小鼠，各組間注意小鼠周齡、體重、生理狀態(tài)等相匹配。

1.2.2組織荷菌量 無菌條件下取小鼠左下葉肺組織0.04 g，加1 ml生理鹽水于玻璃勻漿器中充分研磨，再用等體積4%NaOH消化30 min后作倍比稀釋(10-1和原液)，吸取100 μl肺組織勻漿液接種于羅氏固體斜面培養(yǎng)基，37℃孵箱培養(yǎng)4～5周后進行菌落計數(shù)。

1.2.3病理學檢測 小鼠肺組織用10%甲醛固定,常規(guī)梯度酒精脫水，代替二甲苯安全液透明，軟蠟硬蠟各浸泡1.5 h后將組織塊包埋。切片機調節(jié)切片厚度為4～6 μm,烘片后不同濃度酒精脫蠟，進行蘇木素伊紅染色，另取部分切片抗酸染色，顯微鏡下觀察肺組織病變情況并中性樹脂封片。

1.2.4外周血和肺組織單個核細胞的分離 稀釋0.05%(w/v)膠原酶和0.01%(w/v)胰蛋白酶抑制劑于RPMI1640液制成酶解液，剪碎小鼠肺組織并加入稀釋過的膠原酶，37℃消化30 min，用5 ml組織勻漿液研磨組織后用200目不銹鋼濾網過濾到離心管內，500 g離心15 min，棄上清，樣本稀釋液懸浮沉淀為單細胞懸液。用吸管小心吸取組織單細胞懸液和肝素抗凝外周血于等量的分離液液面上，450 g離心30 min后吸取單個核細胞層。

1.2.5單核細胞P35、EBI3表達的檢測 采用流式細胞術胞內細胞因子染色法檢測P35與EBI3在單核細胞中的表達，取100 μl含1×106個外周血或肺組織單個核細胞于流式管中，每管加200 μl破膜劑(BD Cytofix/Cytoperm)4℃避光反應20 min，用1 ml清洗液(1×BD Perm/Wash)1 500 r/min，5 min洗滌2次，倒掉上清并控干后加入推薦量熒光標記的抗體(EBI3-APC、P35-FITC)10 μl，振蕩混勻，室溫避光孵育30 min；再次洗滌2次，棄上清，最后加入200 μl 2%多聚甲醛溶液固定，上流式細胞儀分析，根據(jù)前向和側向散射兩個物理參數(shù)圈定單核細胞，再根據(jù)熒光波長分析P35和EBI3在單核細胞中的表達。

2 結果

2.1肺組織病理學分析和荷菌量檢測 小鼠肺組織病理切片主要表現(xiàn)為肺泡結構塌陷破壞，肺泡腔內充滿以中性粒細胞為主，伴單個核細胞浸潤的炎性病變，紅細胞滲出明顯；抗酸染色示肺泡周圍分枝桿菌為散在細長略帶彎曲的紅色桿菌。解剖小鼠取肺組織左下葉進行細菌負載量分析，發(fā)現(xiàn)小鼠感染后2周肺部荷菌量達到(5.529±0.246 1)log10CFU，在感染后4周下降至(4.911±0.336 9)log10CFU，感染后8周又顯著升高到(6.550±0.272 4)log10CFU(P<0.001)，見圖1。

2.2P35在BCG感染小鼠外周血與肺組織中單核細胞內高表達 對BCG感染小鼠外周血和肺部不同時間點單核細胞中P35表達情況進行分析，結果發(fā)現(xiàn)實驗組外周血和肺組織中表達P35的單核細胞在2、4、8周的比例均高于相應對照組(P<0.05或P<0.01)。BCG感染后第4周小鼠外周血表達P35的單核細胞明顯增加(P<0.05)，而在第8周又有所下降(P<0.05)。肺組織中表達P35的單核細胞明顯高于對照組，而實驗組各時間點差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖2。

2.3EBI3在BCG感染小鼠外周血與肺組織中單核細胞內高表達 對BCG感染小鼠外周血和肺組織中單核細胞不同時間點EBI3表達情況分析，發(fā)現(xiàn)實驗組外周血和肺組織中表達EBI3的單核細胞在2、4周均高于相應對照組(P<0.05或P<0.01)，小鼠感染組外周血表達EBI3的單核細胞在第4周明顯增加(P<0.05)，而第8周又顯著下降(P<0.01)，肺組織表達EBI3的單核細胞在BCG感染后第4、8周明顯增加(P<0.05)，見圖3。

圖1BCG感染后小鼠肺組織病理改變和荷菌量檢測

Fig.1AfterBCGinfectioninmicelungtissuepathologychangeandamountofbacteriadetection

Note: A.The experimental group of lung tissue sections HE staining(×20)；B.Control group lung tissue sections HE staining(×20)；C.Lung tissue sections acid-fast staining(×100)；D.Analysis of bacteria at each time point in lung tissue.***.P<0.001.

圖2不同感染時間外周血和肺組織中表達P35單核細胞的比較

Fig.2ComparisonofexpressionofP35monocytesinperipheralbloodandlungtissueatdifferenttimeofinfection

Note: A.Peripheral blood and lung tissue monocyte expression P35 flow pattern；B.P35 expression in peripheral blood mononuclear cells；C.P35 expression in lung mononuclear cells.*.P<0.05;**.P<0.01.

圖3不同感染時間外周血和肺組織中表達EBI3單核細胞的比較

Fig.3ComparisonofexpressionofEBI3monocytesinperipheralbloodandlungtissueatdifferenttimeofinfection

Note: A.Peripheral blood and lung tissue mononuclear cells expressing EBI3 flow pattern；B.EBI3 expression in peripheral blood mononuclear cells；C.Expression of EBI3 in lung tissue monocytes.*.P<0.05;**.P<0.01.

圖4不同感染時間外周血和肺組織中產IL-35單核細胞的比較及相關性分析

Fig.4ComparisonandcorrelationanalysisofIL-35mononuclearcellsinperipheralbloodandlungtissueatdifferenttimeofinfection

Note: A.Peripheral blood and lung tissue mononuclear cells express IL-35 flow pattern;B.IL-35 expression in peripheral blood mononuclear cells;C.IL-35 expression in lung mononuclear cells;D.P35 correlation with EBI3(n=19);E.Correlation analysis of lung IL-35 and bacteria(n=15).*.P<0.05;**.P<0.01.

2.4單核細胞IL-35在BCG感染小鼠外周血與肺組織中高表達 對BCG感染小鼠外周血和肺組織不同時間點單核細胞中IL-35表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)實驗組外周血和肺組織單核細胞中由P35和EBI3雙亞基組成的IL-35表達水平顯著高于相應對照組(P<0.05或P<0.01)。BCG感染后小鼠外周血產IL-35的單核細胞在第8周明顯降低(P<0.01)，肺組織中產IL-35的單核細胞在第4周有顯著性增加(P<0.01)。單核細胞中P35與EBI3的表達呈顯著正相關(P<0.001)，肺組織單核細胞中IL-35的表達與載菌量呈負相關(P<0.05)，見圖4。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)：①BCG感染小鼠外周血和肺組織不同周期時單核細胞中IL-35及其兩個亞基P35及EBI3表達明顯高于對照組，且在4周時增加明顯，到8周又有所下降；②感染小鼠肺組織各時間點產IL-35單核細胞與荷菌量存在負相關關系。

單核細胞和組織巨噬細胞經抗原刺激活化可生成并釋放多種細胞因子以參與機體防衛(wèi)機制，在抵御及清除病原體入侵的機體天然免疫中非常重要[17-19]。本實驗采用流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)BCG感染小鼠外周血和肺組織單核細胞中P35 和EBI3的表達在感染后2、4、8周均較對照組有顯著增加，且實驗組表現(xiàn)出感染后4周顯著增加而第8周減少的趨勢，可見單核細胞中P35 和EBI3的表達在機體抵抗外來抗原刺激的免疫反應時明顯增加。關于單核細胞中P35或EBI3單個亞基的表達在免疫性疾病中的比例變化及調節(jié)機制的研究已有報道，研究發(fā)現(xiàn)EBI3基因缺陷小鼠感染肝炎病毒后死亡率增高，T細胞和單核巨噬細胞增多使免疫應答過激而加重炎癥反應[20]；本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，活動性肺結核患者外周血中不僅單個核細胞高表達P35和EBI3兩個亞基的mRNA，而且P35+CD4+T細胞數(shù)與EBI3+CD4+T細胞數(shù)呈正相關。結合上述研究推測小鼠在感染BCG后誘發(fā)宿主單核細胞表達較多的P35和EBI3可增強對抗MTB入侵感染機體的炎癥反應，而P35和EBI3的增加又能提高單核細胞清除病原體能力，這或許可為研究單核細胞參與抗結核免疫應答機制提供新的思路。

本實驗相關性分析發(fā)現(xiàn)P35和EBI3在單核細胞中的表達增高，且呈正相關，感染小鼠外周血單核細胞中IL-35的表達(流式細胞術分析P35和EBI3雙陽性)在2、4周比對照組明顯升高，而實驗組肺組織在2、4、8周較對照組增加均有統(tǒng)計學差異，提示由P35和EBI3雙亞基組成的IL-35可能在單核細胞主導的免疫調節(jié)中發(fā)揮著抑制病情進展的保護性作用，小鼠外周血感染第8周時產IL-35的單核細胞與對照組沒有差異，可能是病程后期MTB全部定植到肺組織導致機體局部單核巨噬細胞表達IL-35介導免疫調節(jié)。有文獻表明重組基因pVAX-IL-35在小鼠哮喘模型中可以產生長效的免疫抑制，有效降低氣道的過敏性炎癥反應[21]；IL-35還可通過減少過量的病原體細胞在靶器官聚集而有效限制疾病的發(fā)生發(fā)展[22]。另一方面，實驗組小鼠肺組織各時間點的荷菌量和單核細胞中IL-35的表達呈負相關，當機體感染第8周時，少數(shù)毒性較強的MTB能逃避單核細胞的溶解吞噬作用而大量繁殖增生，單核細胞中IL-35的表達卻相應減少，提示免疫炎癥抑制因子IL-35的增加也許對調節(jié)感染機體免疫狀態(tài)、增強免疫清除效果和避免病理損傷起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)T細胞在與抗原或人鼻病毒激活的DC接觸活化后，IL-35的基因水平和蛋白表達均顯著升高，且表現(xiàn)出增殖依賴性[23，24]。目前，產IL-35的單核細胞在結核免疫的相關研究機制還未見報道。機體在感染BCG后，單核細胞經MTB刺激活化可分泌包括IL-35在內的多種免疫抗炎因子以介導吞噬降解病原菌的抗結核炎癥反應[25]，IL-35則可促進抑制性細胞因子分泌和影響多個T細胞亞群的分化及功能，明顯降低炎癥反應，從而有效減緩結核病程進一步惡化，推測產IL-35的單核細胞升高可能在小鼠針對結核感染疾病中具有抑制性免疫保護作用，因此，單核細胞中IL-35的表達可能對維持機體免疫平衡具有不容忽視的調控作用，有望為結核病的臨床診斷、治療和預后尋求更準確有效的檢測指標。

動物模型遺傳背景相似，可方便有效研究人類疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律[26,27]，尾靜脈注射雖不如氣溶膠霧化的方式更能模擬人自然感染，但血液輸注較易使組織荷菌量控制在同一水平，本實驗選擇對BCG感染有較強抵抗能力的C57小鼠[28]，小鼠肺組織抗酸染色可見MTB成功侵襲感染肺部，雖不足以引發(fā)典型結核結節(jié)出現(xiàn)，肺組織依然可見肺泡結構紊亂和炎癥細胞聚集等病變表現(xiàn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BCG感染小鼠外周血和肺組織中產IL-35的單核細胞在第4周顯著增加，肺組織單核細胞內IL-35的表達和荷菌量呈負相關，提示單核細胞表達IL-35的升高增強了機體抵抗MTB感染的結核免疫反應。然而，產IL-35的單核細胞調節(jié)免疫應答的作用機制以及IL-35在人與鼠體內表達方式的差異還有待我們進一步研究探討和深入了解。

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