雷帕霉素激活自噬改善嘌呤霉素氨基核苷誘導的足細胞損傷①

詹慧芳 劉文娟 金 娟 龔建光 趙 黎 何 強

(浙江大學校醫院紫金港校區，杭州 310058)

足細胞(Podocyte)是一類位于腎小球毛細血管基底膜外側的臟層上皮細胞，因其胞漿在基底膜表面形成偽足樣突起而得名，足突之間的裂孔膜是腎小球濾過的最后一道屏障，因此足細胞的損傷將導致蛋白尿的出現。腎小球疾病發生過程中的許多因素都可能導致足細胞結構和功能的改變，使得腎小球血液濾過屏障被破壞，進而推動腎小球疾病進展直至終末期腎病。近年來，關于足細胞的研究成為腎小球疾病關注的熱點。大量的研究證實，自噬在足細胞損傷中發揮重要作用[1-3]。嘌呤霉素氨基核苷(Puromycin amino nucleoside，PAN)腎病模型是常用的足細胞損傷模型，有研究證實，雷帕霉素可以促進Nephrin蛋白表達顯著增加，改善PAN所致的足細胞損傷，雷帕霉素還能減輕PAN腎病小鼠蛋白尿的程度[4,5]。然而足細胞自噬是否在雷帕霉素對PAN足細胞損傷模型的保護中發揮作用還不得而知。因此，本研究擬通過PAN足細胞損傷模型，觀察足細胞自噬改變，探尋雷帕霉素對足細胞保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 雷帕霉素購于美國Selleck，RMPI-1640/DMEM培養基購于美國Hyclone，重組的小鼠 γ-干擾素(IFN-γ)購于美國 Peprotech，AnnexinV/PI Apoptosis Detection Kit APC購于美國eBioscience，CCK-8試劑盒、羊抗兔HRP標記二抗購自上海碧云天生物技術有限公司，兔抗鼠LC3、p62.4EBP1、P70S6K、mTOR購自美國Proteintech，兔抗鼠P-4EBP1、P-P70S6K、P-mTOR購自美國Affinity，BCA蛋白定量試劑盒購于Thermos公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養和分組 小鼠永生化足細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，將細胞移入5 ml含10% FBS的RPMI1640培養液中，1 200 r/min離心5 min，傾去含DMSO的上清；加入含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養液5 ml，輕柔吹打至細胞呈單個，將其移入培養瓶；加入50 U/ml γ干擾素，放入33℃、5%CO2培養箱中培養，2 d更換一次培養液。待細胞長滿70%～80%時，用PBS洗滌，0.25%胰蛋白酶消化后，加入RPMI1640培養液傳代培養。將含有50 U/ml γ干擾素的培養基換成不含有干擾素的培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中，每2 d更換一次培養液，待10～14 d足細胞即分化成熟，進行后續實驗分組和操作。根據不同的處理分成對照組(Control組)，PAN組(加入50 μg/ml PAN)，雷帕霉素組(RAP組：分別加入100、200、300 ng/ml雷帕霉素)，PAN+雷帕霉素組(PAN+RAP組：細胞在用含PAN的培養液培養前1 h，分別用100、200、300 ng/ml雷帕霉素進行預處理1 h)。

1.2.2CCK-8檢測足細胞生長 取對數生長期小鼠腎足細胞，胰蛋白酶消化，稀釋細胞使其濃度為(1～5)×105個細胞/ml，分別取100 μl至96孔板，33℃、5%CO2飽和濕度培養。按上述分組處理足細胞，給藥24 h后，按1∶10體積比混合Cell Counting Kit-8和無血清的RPMI1640，每孔100 μl加入待測孔，33℃、5%CO2培養箱中孵育1 h；酶標儀測定450 nm處吸光度值。

1.2.3Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 細胞培養及分組處理同上，吸取細胞培養液至合適離心管，PBS小心清洗細胞一次，加入適量胰酶消化細胞，室溫孵育后小心吸除胰酶，向離心管中加入細胞培養液小心吹散。1 000×g，離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數；取(5～10)×104個重懸的細胞，1 000×g，離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-APC結合液輕輕重懸細胞。加入5 μl Annexin V-APC，輕輕混勻，4℃避光孵育15 min。加入5×PI染色液，輕輕混勻，4℃避光孵育5 min，同時以不加Annexin V-APC及PI的一管為陰性對照。流式細胞儀檢測，Annexin V-APC對應BD流式細胞儀FL4檢測通道，PI對應BD流式細胞儀FL2檢測通道。

1.2.4透射電鏡觀察自噬小體 各組細胞處理24 h 后，用細胞刮將玻片上的細胞刮下，將培養液離心，制備超薄切片后在透射電鏡下觀察。

1.2.5Western blot檢測LC3、p62、4EBP1、P70S6K、mTOR蛋白表達 收集各組細胞，充分裂解、離心后取上清，BCA法蛋白定量。蛋白樣品加入4×SDS loading buffer，沸水煮沸 5～10 min，離心。取 50 μg總蛋白加入SDS-PAGE凝膠上樣孔內，電泳結束后，將NC膜在甲醇中浸泡，再使用Transfer Buffer浸泡凝膠、濾紙和NC膜，制備轉移三明治。轉膜完畢后，封閉，加一抗 4℃孵育過夜，加入稀釋好的二抗，室溫孵育2 h。ECL 檢測樣本免疫活性凝膠成像系統分析。

2 結果

2.1CCK-8法檢測細胞生長 采用CCK-8試劑盒檢測各組小鼠足細胞的增殖情況。結果如圖1所示，與對照組比較，PAN組的細胞生長受到顯著抑制(P<0.01)，100 ng/ml RAP對足細胞生長沒有明顯的抑制作用(P>0.05)，200 ng/ml RAP組的細胞受到顯著抑制(P<0.05)，300 ng/ml RAP組、PAN+100 ng/ml RAP組、PAN+200 ng/ml RAP組以及PAN+300 ng/ml RAP組的細胞增殖均受到顯著抑制(P<0.01)。與PAN組比較，PAN+100 ng/ml RAP組、PAN+200 ng/ml RAP組及PAN+300 ng/ml RAP組的細胞生長抑制作用得到顯著改善(P<0.01)。

2.2雷帕霉素抑制PAN誘導的足細胞凋亡 采用Annexin V/PI雙染法檢測不同處理組小鼠腎足細胞凋亡情況。結果顯示，與對照組比較，PAN組、RAP組和PAN+RAP組細胞凋亡率均顯著增加(P<0.001)。與PAN組比較，RAP+PAN組細胞凋亡率顯著減少(P<0.001)。與RAP組比較，RAP+PAN組細胞凋亡率顯著增加(P<0.001)。見圖2A、B。

2.3雷帕霉素對PAN誘導的足細胞自噬活性的影響 Western blot檢測各組小鼠足細胞自噬標記物LC3和p62的表達。結果顯示，與 Control 組比較，PAN 組 LC3Ⅱ蛋白表達顯著下調，而p62蛋白表達顯著上調；RAP 組 LC3Ⅱ蛋白表達明顯上調，而p62蛋白表達顯著下調。 與 PAN 組比較，PAN+RAP組LC3Ⅱ蛋白表達上調，p62蛋白表達顯著下調，見圖3A～C。透射電鏡觀察各組細胞自噬小體，如圖3D所示，Control組胞漿中可見較多自噬小體；PAN組胞漿內可見較多空泡，自噬體明顯減少；RAP組胞漿內可見大量空泡和自噬體；與PAN組比較，RAP+PAN組胞漿局部自噬體數量增加。

圖1 各組細胞增殖情況Fig.1 Proliferation of cells in each groupNote: *.P<0.05，**.P<0.01 vs Control group；#.P<0.05，##.P<0.01.

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡情況Fig.2 Flow cytometric dot plots of Annexin V and propidium iodide(PI) stainingNote: The concentration of puromycin amino nucleoside is 50 μg/ml.The concentration of rapamycin is 100 ng/ml.A.Flow cytometric dot plots of Annexin V and propidium iodide(PI)staining;B.Bar graph showed the percentage of cells apoptosis.***.P<0.001 vs control;###.P<0.001 vs PAN;△△△.P<0.001 vs PAN+RAP.

圖3 Western blot檢測各組小鼠足細胞自噬標記物LC3和p62的表達及透射電鏡觀察各組細胞自噬小體(×20 000)Fig.3 Expression of LC3 and p62 protein detected by Western blot and autophagosomes(arrows)detected by transmission electron microscopy in podocytes of individual groups(×20 000)Note: A.Representative band of LC3 and p62 protein in individual groups;B and C.Bar graph showed the relative expression of LC3II and p62 protein;D.Autophagosomes(arrows) detected by transmission electron microscopy in the podocytes of individual groups.

圖4 Western blot檢測各組細胞mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、P70S6K、p-P70S6K蛋白表達Fig.4 Expression of mTOR，p-mTOR，4EBP1，p-4EBP1，P70S6K and p-P70S6K protein detected by Western blotNote: A.Representative band of mTOR，p-mTOR，4EBP1，p-4EBP1，P70S6K and p-P70S6K protein in individual groups;B.Bar graph showed the relative expression of p-mTOR/mTOR，p-4EBP1/4EBP1 and p-P70S6K/P70S6K.

2.4mTOR信號通路在雷帕霉素激活PAN誘導的足細胞自噬活性中的作用 Western blot檢測各組細胞mTOR信號通路蛋白，結果如圖4A、B所示，與 Control 組比較，PAN 組 mTOR、 4EBP1、 P70S6K 磷酸化水平上調，RAP 組 mTOR、4EBP1、 P70S6K 磷酸化水平下調。 與 PAN 組比較，PAN+RAP 組 mTOR、 4EBP1、 P70S6K磷酸化水平下調?？梢?，mTOR、 4EBP1、 P70S6K 磷酸化水平與足細胞自噬活性成負相關。

3 討論

自噬(Autophagy)是一種高度保守的細胞內蛋白再循環機制，它能導致不同于凋亡的不依賴于caspase途徑的程序性細胞死亡。自噬廣泛存在于正常的生理過程中，維護著細胞的內環境穩定。自噬可使細胞應對各種細胞內外應激，然而過度的自噬或自噬不足，均可對機體造成損害。許多的腎小球疾病如膜性腎病[2]、糖尿病腎病[6]、局灶節段腎小球硬化癥[7]等都表現為足細胞自噬活性的下調。我們的結果顯示PAN處理足細胞24 h后，自噬標記物LC3Ⅱ明顯下調，而p62蛋白出現堆積而上調，表明自噬受到抑制；流式細胞術結果顯示細胞凋亡率顯著下降，與文獻報道的結果一致[8]。

雷帕霉素是一種新型的免疫抑制劑,是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin mTOR)信號通路特異性的負調控因子。mTOR屬于磷酸肌醇3激酶超家族成員，是平衡細胞生長和自噬通路中的重要調節因子，起著應對胞內各種生理反應和外部環境壓力的作用[9]。我們發現100 ng/ml 的雷帕霉素對正常足細胞不會出現抑制，但可以顯著抑制PAN誘導的足細胞凋亡。雷帕霉素預處理后，PAN誘導的足細胞凋亡率由原來的38.5%下降為24.1%。進一步研究發現，與PAN處理相比，雷帕霉素可以顯著提升足細胞LC3Ⅱ蛋白的表達，同時降低p62蛋白的水平，可見自噬水平得到激活。同樣，透射電鏡的結果顯示雷帕霉素促進自噬小體的形成，自噬活性得到提升。激活自噬后，細胞將暫停合成功能并降解損傷細胞器及相關蛋白(包括損傷線粒體及 caspase 酶等)，為細胞生存及修復提供能量和原料，減輕細胞損傷程度，從而延緩凋亡發生[10]。

另外，起始因子 4E 結合蛋白(eukaryotic initiat-ion factor 4E binding protein 1，4EBP1)和核糖體40S小亞基S6蛋白激酶(70-kD ribosomal protein S6 kinase，p70S6K)是mTOR通路下游的兩種靶蛋白，正常生理條件下，mTOR處于活化狀態，不僅可以磷酸化下游 Atg 蛋白直接抑制自噬激活，還可以磷酸化真核細胞4EBP1及 p70S6K進而抑制自噬[11,12]。當mTOR的活性被抑制，4EBP1及 p70S6K的磷酸化將受到抑制，4EBPl與eIF4E 親和力升高，S6K磷酸化水平下降，翻譯起始復合物形成被抑制，翻譯效率下降和限制細胞增殖[13,14]。我們的研究表明，PAN可以促進mTOR、4EBP1及p70S6K的磷酸化，而雷帕霉素可以抑制mTOR、4EBP1及p70S6K活化，說明雷帕霉素可能通過靶向抑制mTOR信號通路的活化來促進自噬的激活，從而達到足細胞的保護作用。

總之，我們的研究顯示，雷帕霉素可通過激活自噬改善PAN誘導的足細胞損傷，mTOR/4EBP1、P70S6K信號通路在自噬活化中可能起到重要作用，這對進一步了解雷帕霉素對足細胞保護作用具有重要意義。

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