MiR-126通過MAPK信號通路抑制oxLDL處理的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移

鄭 茜 張 勇 楊東偉

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，鄭州 450000)

越來越多的研究表明小RNA(microRNAs,miRNAs)在動脈粥樣硬化的病理生理細(xì)胞效應(yīng)及分子信號通路中起著重要的調(diào)控作用[1]。MiRNAs是一類小非編碼RNA序列，長約22個核苷酸，目前已發(fā)現(xiàn)2 042種miRNAs[2]。這些miRNAs共同調(diào)控著基因組中三分之一的基因，而且miRNAs與多種疾病相關(guān)[3]。MiRNAs在神經(jīng)性疾病、哮喘及癌癥等疾病中都起著重要作用[4-8]。MiR-126在多種癌癥中都低表達(dá)，可通過抑制癌細(xì)胞生長、遷移及侵襲等影響癌癥進(jìn)程[9]。MiR-126在心血管疾病中也具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)血漿中的miR-126水平與冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成呈正相關(guān)[10]。有數(shù)據(jù)顯示在伴有多種血管疾病的冠狀動脈疾病患者中miR-126低表達(dá)[11]。在心肌缺血再灌注損傷中，miR-126表達(dá)下調(diào)，miR-126可保護(hù)由缺血再灌注引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡[12]。大量文獻(xiàn)報道m(xù)iR-126具有保護(hù)血管和動脈粥樣硬化的功能[13]。過表達(dá)miR-126可減弱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡抑制深靜脈血栓形成[14]。有研究表明內(nèi)皮微顆粒可通過向受體細(xì)胞輸送功能性的miR-126來促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)[15]。本文主要目的是利用氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)處理人主動脈血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)，研究miR-126對oxLDL處理的VSMC生物學(xué)功能的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系及主要試劑 人主動脈血管平滑肌細(xì)胞系T/G HAVSMC購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)；oxLDL購自美國Kalen Biomedical公司；促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路激活劑Anisomycin購自碧云天生物科技公司；SmGM-2培養(yǎng)基購自瑞士Lonza龍沙公司；胎牛血清及轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent購自賽默飛世爾科技公司；血脂檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒RNAiso Plus reagent購自大連TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)公司；Transwell小室購自美國BD公司；增殖標(biāo)記蛋白細(xì)胞增殖核抗原-67(Antigen identified by monoclonal antibody,Ki-67)和增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，遷移標(biāo)記蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloprotein 9,MMP-9)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體購自美國NEB公司；MAPK信號通路相關(guān)蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK和p-JNK抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理和轉(zhuǎn)染 人主動脈血管平滑肌細(xì)胞T/G HAVSMC于含5%胎牛血清的SmGM-2培養(yǎng)基中置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用生理鹽水處理T/G HAVSMC細(xì)胞24 h作為對照組，用50 mg/ml的oxLDL處理T/G HAVSMC細(xì)胞24 h作為模型組。依照轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent說明書用miR-126 mimic和mimic control分別對模型組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并添加MAPK信號通路激活劑Anisomycin。

1.2.2膽固醇及三酰甘油水平檢測 oxLDL處理T/G HAVSMC后收集細(xì)胞上清，按照試劑盒說明書測定總膽固醇(Serum total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipopro-tein cholesterol,HDL-C)和三酰甘油(Triglyceride,TG)。

1.2.3實時定量PCR(Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) 用RNA提取試劑盒提取總RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。miR-126上游引物：GCTGTCAGTTTGTC-AAATAC，miR-126下游引物：GTGCAGGGTCC-GAGGT。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM說明書進(jìn)行qRT-PCR，用公式2-ΔΔCt計算miR-126的相對表達(dá)量。

1.2.4CCK-8檢測細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染0、1、2、3、4、5 d后，CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖倍數(shù)。首先將CCK-8溶液稀釋到10%，然后用上述稀釋液將待測的細(xì)胞制成1×106個/ml的懸液，37℃培養(yǎng)1～4 h，最后450 nm處檢測吸光值，計算細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.2.5Transwell分析細(xì)胞遷移 待測細(xì)胞懸浮于無胎牛血清的培養(yǎng)基中至細(xì)胞密度為1×106個/ml，然后將細(xì)胞懸液加入到Transwell的上室中，在下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h后，0.5%的結(jié)晶紫對上室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，并用棉簽將上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞除去。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并隨機選取5個視野統(tǒng)計每個視野下被染色的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6免疫印記 收集待測細(xì)胞，用PBS洗3次，然后加入已添加蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解后提取總蛋白。等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%的BSA進(jìn)行封閉后，依次孵育一抗和二抗，最后進(jìn)行顯色。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1oxLDL對VSMC脂質(zhì)代謝的影響 用50 mg/ml的oxLDL處理T/G HAVSMC細(xì)胞24 h后檢測模型組和對照組中TC、TG、LDL-C、HDL-C的濃度。如表1所示，模型組中TC、TG和LDL-C的濃度遠(yuǎn)高于對照組，HDL-C的濃度則現(xiàn)顯著低于對照組(P<0.001)。這些指標(biāo)的變化說明，oxLDL處理T/G HAVSMC后脂質(zhì)代謝異常。

2.2oxLDL處理VSMC可降低miR-126表達(dá) 利用qRT-PCR檢測對照組和模型組中miR-126的表達(dá)，如圖1所示，模型組中miR-126相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。由此可見，在oxLDL處理T/G HAVSMC的模型中miR-126下調(diào)表達(dá)。

2.3增強oxLDL處理的VSMC中miR-126的表達(dá) 將miR-126 mimic和mimic control分別轉(zhuǎn)染模型組細(xì)胞，qRT-PCR檢測各組細(xì)胞miR-126的表達(dá)情況。如圖2所示，模型組和mimic control組中miR-126的相對表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.01)。miR-126 mimic組中miR-126的相對表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模型組(P<0.001)。這些結(jié)果說明，miR-126 mimic轉(zhuǎn)染效果顯著，大大地提高了模型組細(xì)胞miR-126的表達(dá)。

GroupsTC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL?C(mmol/L)HDL?C(mmol/L)Control1 28±0 080 84±0 090 73±0 110 61±0 07Model6 78±0 161)5 89±0 181)7 08±0 231)0 39±0 051)

Note：TC.Total cholesterol;TG.Triglyceride;LDL-C.Low density lipoprotein cholesterin;HDL-C.High density lipoprotein cholesterol.Compared with control group,1)P<0.001.

2.4miR-126對oxLDL誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響 為分析miR-126在oxLDL處理的VSMC中對細(xì)胞增殖的影響，利用CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖倍數(shù)。圖3結(jié)果顯示，與對照組相比，oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型組和mimic control組細(xì)胞增殖倍數(shù)在轉(zhuǎn)染后第2天開始明顯增加(P<0.05)，轉(zhuǎn)染后第3天則顯著增多(P<0.01)，轉(zhuǎn)染4 d以后則極顯著升高了(P<0.001)。模型組中轉(zhuǎn)染miR-126 mimic后第3天開始細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯低于模型組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染4 d以后增殖倍數(shù)顯著減少(P<0.01)。由此可見，miR-126 mimic可抑制oxLDL誘導(dǎo)的VSMC增殖的增加。

圖1 qRT-PCR檢測oxLDL處理后miR-126的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-126 was tested by qRT-PCR after treatment with oxLDLNote: Compared with control group,**.P<0.01.

圖2 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-126 mimic后miR-126的表達(dá)Fig.2 Expression of miR-126 was tested by qRT-PCR after transfection with miR-126 mimicNote: Compared with control group,**.P<0.01;comprared with model group,###.P<0.001.

2.5miR-126在oxLDL處理的VSMC中對細(xì)胞遷移的影響 Transwell檢測各組細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，模型組和mimic control組遷移細(xì)胞數(shù)最多，其次是miR-126 mimic組，對照組遷移細(xì)胞數(shù)最少(圖4A)。如圖4B所示，模型組和mimic control組中平均每個視野的遷移細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組(P<0.001)。與模型組相比，miR-126 mimic組遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.01)。上述結(jié)果表明，miR-126 mimic可減弱oxLDL對VSMC遷移能力的促進(jìn)作用。

2.6miR-126對細(xì)胞增殖和遷移標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響 為進(jìn)一步驗證miR-126在oxLDL處理的VSMC中對細(xì)胞增殖和遷移的影響，免疫印跡檢測各組細(xì)胞增殖和遷移標(biāo)記蛋白表達(dá)。圖5A顯示，增殖和遷移標(biāo)記蛋白Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF在模型組和mimic control組中表達(dá)最強，miR-126 mimic組較低，對照組表達(dá)最弱。由圖5B可知，模型組和mimic control組中Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF的相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.01)。與模型組相比，miR-126 mimic組Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF的相對表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。這些結(jié)果說明，oxLDL可增強VSMC中細(xì)胞增殖和遷移標(biāo)記蛋白表達(dá)。

圖3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖Fig.3 Cell proliferation was detected by CCK-8Note: Compared with control group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;compared with model group,#.P<0.05,##.P<0.01.

圖4Transwell檢測細(xì)胞遷移(結(jié)晶紫染色,×100)

Fig.4MigrationwasmeasuredbyTranswell(crystalvioletstaining，×100)

Note: A.Crystal violet staining；B.Histogram represents the statistical analysis of Transwell migration.Compared with model group,***.P<0.001;compared with model group,##.P<0.01.

2.7miR-126對MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為探索miR-126在oxLDL處理的VSMC中的分子調(diào)控機制，免疫印跡分析MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。如圖6A所示，磷酸化的蛋白p-ERK1/2、p-p38、p-JNK在模型組和mimic control組表達(dá)量最多，其次是miR-126 mimic，對照組中表達(dá)量最少，但各組細(xì)胞中ERK1/2、p38、JNK蛋白表達(dá)無明顯變化。圖6B顯示，與對照組相比，模型組和mimic control組中p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38、p-JNK/JNK的相對蛋白表達(dá)量的比值顯著升高(P<0.01)，miR-126 mimic組p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38、p-JNK/JNK的相對蛋白表達(dá)量的比值則明顯低于模型組(P<0.05)。由此可見，miR-126 mimic可降低oxLDL引起的VSMC中MAPK信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的升高，抑制MAPK信號通路活化。

圖5 免疫印跡檢測細(xì)胞增殖和遷移標(biāo)記蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of proliferation and migration marker proteins was tested by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram represents the statistical analysis of Western blot.Compared with control group,**.P<0.01；compared with model group,#.P<0.05.

圖6 免疫印跡檢測MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.6 Expression of MAPK pathway related proteins was tested by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot;B.Histogram represents the statistical analysis of Western blot.Compared with control group,**；P<0.01;compared with model group,#.P<0.05.

圖7 免疫印跡檢測細(xì)胞增殖和遷移標(biāo)記蛋白的表達(dá)Fig.7 Expression of proliferation and migration marker proteins was tested by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram represents the statistical analysis of Ki-67 and PCNA；C.Histogram represents the statistical analysis of MMP-9 and VEGF,compared with control group,**.P<0.01,compared with model group,#.P<0.05.

2.8miR-126通過MAPK信號通路發(fā)揮作用 為進(jìn)一步確認(rèn)miR-126是通過MAPK信號通路來發(fā)揮作用，添加MAPK信號通路激活劑Anisomycin檢測各組細(xì)胞增殖和遷移標(biāo)記蛋白表達(dá)。圖7A顯示，增殖和遷移標(biāo)記蛋白Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF在Anisomycin組中表達(dá)最高。如圖7B和7C所示，與對照組相比，模型組Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，miR-126 mimic組Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF表達(dá)明顯降低(P<0.05)；Anisomycin組Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF表達(dá)明顯升高(P<0.05)。miR-mimic+ Anisomycin組Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF表達(dá)與模型組無明顯差異。由此可見，MAPK信號通路激活劑Anisomycin可逆轉(zhuǎn)miR-126 mimic對oxLDL處理的VSMC增殖和遷移的影響。上述結(jié)果表明，miR-126可通過抑制MAPK信號通路減弱oxLDL誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移。

3 討論

動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中會出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，炎性細(xì)胞招募，脂質(zhì)和基質(zhì)的積累以及血栓的形成[16]。針對這些變化，目前對于動脈粥樣硬化的治療策略主要包括生活方式的改變、降膽固醇降血壓藥物和抗血栓藥物以及外科手術(shù)治療，但是這些方法并非對所有的患者有效[17]。尋找開發(fā)新的治療方案具有重大意義。隨著分子生物學(xué)水平的提高，基因治療已經(jīng)成為一種極具潛力的疾病治療手段。表達(dá)譜分析表明，在動脈粥樣硬化的病理背景下，許多miRNAs在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中都表達(dá)異常[18]。這揭示這些miRNAs可能在動脈粥樣硬化中起著重要作用，具有成為治療靶點的可能。

大量文獻(xiàn)報道了miRNAs在多種疾病中對細(xì)胞增殖具有重要的調(diào)控作用。在胰島瘤細(xì)胞中，miR-126可抑制葡萄糖引起的細(xì)胞增殖[19]。Yu等[20]發(fā)現(xiàn)miR-126上調(diào)表達(dá)會導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞增殖能力降低。miR-126還可調(diào)節(jié)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨膜纖維母細(xì)胞增殖[21]。Schober等[22]發(fā)現(xiàn)miR-126可促進(jìn)內(nèi)皮增生并抑制動脈粥樣硬化病變。血管平滑肌細(xì)胞的增殖是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵過程之一[23]。有數(shù)據(jù)表明oxLDL處理血管平滑肌細(xì)胞會導(dǎo)致miR-141表達(dá)降低，miR-141對血管平滑肌細(xì)胞增殖起著重要的調(diào)控作用[24]。Kim等[25]研究顯示過表達(dá)miR-365可降低血管平滑肌細(xì)胞增殖能力和增殖標(biāo)記蛋白PCNA的表達(dá)。過表達(dá)miR-599可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及增殖標(biāo)記蛋白PCNA和Ki-67的表達(dá)[26]。與前人結(jié)果類似，本文結(jié)果顯示，50 mg/L的oxLDL處理人主動脈血管平滑肌細(xì)胞24 h會導(dǎo)致miR-126表達(dá)減弱，細(xì)胞增殖倍數(shù)及增殖標(biāo)記蛋白表達(dá)升高；而miR-126 mimic則可以降低oxLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖倍數(shù)和增殖標(biāo)記蛋白表達(dá)的增加。這說明，miR-126 mimic在可抑制oxLDL誘導(dǎo)的人主動脈血管平滑肌細(xì)胞T/G HAVSMC增殖能力的升高。

MiRNAs對多種疾病的細(xì)胞遷移也存在很大的影響。在結(jié)腸直腸癌中，增強miR-126表達(dá)可以抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞遷移能力[27]。過表達(dá)miR-126還可抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移[28]。Yang等[29]發(fā)現(xiàn)miR-126可抑制胃癌細(xì)胞遷移能力。血管平滑肌細(xì)胞是動脈管壁最豐富的細(xì)胞且與動脈粥樣硬化有關(guān)。據(jù)報道m(xù)iRNAs還可調(diào)控動脈粥樣硬化中平滑肌細(xì)胞的遷移[30]。有研究顯示miR-379可以抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移[31]。過表達(dá)miR-145和miR-181b會導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞遷移能力降低[32,33]。Cho等[34]發(fā)現(xiàn)miR-761可抑制血管緊縮素引起的血管平滑肌細(xì)胞遷移能力的增強。本研究結(jié)果顯示，oxLDL處理人主動脈血管平滑肌細(xì)胞后，細(xì)胞遷移及遷移標(biāo)記蛋白表達(dá)增強；miR-126 mimic則可以抑制這種oxLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移及遷移標(biāo)記蛋白表達(dá)的升高。這表明，增強miR-126表達(dá)可減弱oxLDL導(dǎo)致的人主動脈血管平滑肌細(xì)胞T/G HAVSMC遷移能力的升高。

眾所周知MAPK信號通路具有重要的生物學(xué)功能。據(jù)報道許多miRNAs是通過MAPK信號通路來發(fā)揮其功能。有研究表明過表達(dá)miR-126可通過調(diào)節(jié)ERK MAPK信號通路促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化[35]。Zuo等[36]發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化中，過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞的miR-26a會導(dǎo)致p-p38水平下降，p38表達(dá)水平無變化，這說明miR-26a可通過p38 MAPK途徑調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞功能。有數(shù)據(jù)顯示在動脈粥樣硬化中miR-136可已通過ERK1/2 MAPK通路調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖[37]。Li等[38]發(fā)現(xiàn)miR-181b可通過調(diào)節(jié)p-ERK1/2/ERK1/2平衡來調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖。本文結(jié)果顯示，在oxLDL處理的VSMC中，MAPK信號通路中的p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38、p-JNK/JNK的相對蛋白表達(dá)量的比值升高，轉(zhuǎn)染miR-126 mimic可降低MAPK信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的增加。而且，MAPK信號通路激活劑Anisomycin可逆轉(zhuǎn)miR-126 mimic對oxLDL處理的VSMC增殖和遷移的影響。上述結(jié)果表明，miR-126可通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)人主動脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。

本研究表明，oxLDL處理人主動脈血管平滑肌細(xì)胞的模型中，細(xì)胞增殖和遷移能力提高，MAPK信號通路中的p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38、p-JNK/JNK比值升高。MiR-126 mimic可降低動脈粥樣硬化中細(xì)胞增殖和遷移能力及MAPK信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的升高。MAPK信號通路激活劑Anisomycin可逆轉(zhuǎn)miR-126 mimic對oxLDL處理的VSMC增殖和遷移的影響。

綜上所述，miR-126可通過MAPK信號通路抑制oxLDL誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移。下一步計劃將通過動物模型對miR-126在動脈粥樣硬化中的作用進(jìn)行體內(nèi)研究，為開發(fā)新的動脈粥樣硬化治療方案奠定基礎(chǔ)。

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