苯并芘與肽聚糖體外協同刺激人皮脂腺細胞炎癥因子表達及其意義

侯霄梟 曹 珂 胡婷婷 潘展硯 Christos C. Zouboulis 鞠 強

環境污染不但參與變態反應性皮膚病、皮膚腫瘤、皮膚老化等皮膚疾病發生，與痤瘡之間也存在密切關聯[1]。環境污染物二噁英誘導氯痤瘡發生[2],吸煙可以引起的“吸煙者痤瘡”[3]，最近也報道了北京大氣污染可以增加尋常痤瘡患者門診就診率[4]。但環境污染物誘發或者加重痤瘡的機制目前仍有待探索。

痤瘡是毛囊皮脂腺單位慢性炎癥性疾病，毛囊內微生物如痤瘡丙酸桿菌激活天然免疫Toll樣受體2(TLR2)并導致促炎癥因子尤其是IL-1α釋放及隨后的炎癥級聯反應發生是痤瘡的重要啟動和加重因素[5]，環境污染物中的主要成分如二噁英、多環芳香烴類化合物(PAHs)等通過芳香烴受體(AHR)影響人體健康。近年來在呼吸系統和腸道系統的研究發現，環境污染物介導的AHR和微生物誘導的TLRs之間存在協同作用，誘導炎癥因子生成，參與呼吸道或者胃腸道炎癥性疾病發生[6,7]。皮膚是保護人體與外界環境的屏障，毛囊中含有痤瘡丙酸桿菌等大量微生物，我們推測環境污染物可能與毛囊內的微生物之間存在類似腸道與呼吸道的協同作用機制。因此我們體外研究環境污染物如PM2.5或者香煙中的主要代表性PAHs苯并芘體外和革蘭氏陽性菌細菌壁成分肽聚糖(PGN)對SZ95人皮脂腺細胞炎癥因子表達的影響，探討環境污染物誘導或加重痤瘡的發生機制。

1 實驗器材與方法

1.1 藥物準備與儀器 PGN(金黃色葡萄球細胞壁提取物，SigmaAldrich，美國)混懸于工作培養基中配置為2 mg/mL，分裝后-20℃備用，使用時稀釋為工作濃度20 μg/mL，苯并芘(SigmaAldrich，美國)溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，配制成10-2mol/L，分裝后-20℃備用，使用時用工作培養基配制至工作濃度10-5M/L，控制DMSO濃度≤1‰。

1.2 細胞培養 SZ95人皮脂腺細胞由德國Dessau臨床醫學中心皮膚科Zouboulis CC教授饋贈，傳代在30-40代的細胞用于實驗，細胞培養于Sebomed基礎培養基中，添加10%胎牛血清、5 μg/L表皮生長因子、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素。置于37℃，5% CO2培養箱中，每2天更換培養液1次。工作時新鮮配制工作培養基，添加2%胎牛血清，余同上。

1.3 RT-PCR法檢測IL-1α,IL-1β及TNF-α mRNA表達的變化 細胞接種于(1×105個細胞/孔)24孔板，復3孔，次日加入PGN和苯并芘至工作濃度，0.1% DMSO作為對照組。作用2 h后，胰酶消化收集細胞，Trizol提取試劑提取總RNA，使用TAKARA試劑盒按照說明書獲得cDNA，檢測基因及引物序列見表1。設置GAPDH對照。RT-PCR檢測反應條件：95℃預變性30 s；之后95℃變性，每次5 s，60℃退火30 s，循環45次，于60℃時收集數據。目的基因mRNA相對表達量采用ΔΔCT進行計算： ΔCT=CT目的基因-CTGAPDH，-ΔΔCT=ΔCTGAPDH-ΔCT目的基因， RQ(相對表達量)目的基因=2-ΔΔCT。

表1 基因及引物序列

1.4 ELISA法檢測IL-1α,IL-1β及TNF-α的釋放 SZ95細胞接種于24孔板中(1×105個細胞/孔)，次日PBS清洗后加入PGN,苯并芘至工作濃度，復3孔，0.1% DMSO作為對照組，24 h后收集細胞上清，4°C 3000 rpm離心后收集上清分裝后-20°C存放待檢測。檢測時，按照IL-1α,IL-1β及TNF-α的ELISA試劑盒說明書操作分別進行操作，并設定空白對照孔，450 nm酶標儀檢測吸光值。根據標準品檢測數值制定標準曲線，得出線性公式，然后根據線性公式計算出相應的樣本濃度，將計算出的樣本濃度與對照組比較，觀察其變化情況。

1.5 統計學方法 所得數據以均數±標準差表示，每組數據獨立重復三次以上，采用Prism GraphPad(La Jolla, CA, USA)進行雙因采方差統計分析，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001 ，采用Graphpad軟件制圖。

2 結果

2.1 PGN和苯并芘體外對皮脂腺細胞IL-1α分泌的影響 PGN刺激SZ95皮脂腺細胞，發現IL-1α mRNA及蛋白的表達明顯增加(圖1a,b)；苯并芘單獨作用于皮脂腺細胞可見IL-1α mRNA的表達沒有明顯增加(圖1a)，但其蛋白表達卻明顯上升(相較于空白對照組P<0.001)；而PGN和苯并芘聯合刺激時發現苯并芘能協同增強PGN刺激皮脂腺細胞IL-1α的表達，與PGN單獨作用組相比,mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.0001)表達均明顯增加(圖1a,b)。

2.2 PGN和苯并芘體外對皮脂腺細胞IL-1β分泌的影響 使用PGN刺激SZ95皮脂腺細胞，IL-1β mRNA (P<0.001)及蛋白(P<0.01)的表達增加；苯并芘單獨作用于皮脂腺細胞可見IL-1β mRNA的表達沒有明顯增加但其蛋白表達有所增加(P<0.05)；同樣，苯并芘的加入可以顯著增強PGN誘導皮脂腺細胞IL-1β mRNA 和蛋白的表達(圖2a,b)。

2.3 PGN和苯并芘對皮脂腺細胞產生TNF-α的影響 使用PGN刺激SZ95皮脂腺細胞，發現TNF-α mRNA(P<0.0001) 及蛋白(P<0.01)表達大量增加；苯并芘單獨刺激皮脂腺細胞不能誘導TNF-α mRNA的表達增加但TNF-α蛋白表達卻增加(P<0.01)；當用PGN和苯并芘聯合刺激皮脂腺細胞時，TNF-α mRNA(圖3a)的表達在PGN組和PGN+苯并芘組中沒有明顯差異。而PGN+苯并芘組中TNF-α蛋白的表達卻明顯高PGN單獨作用組(圖3b)。

圖1 PGN和苯并芘體外對人SZ95皮脂腺細胞IL-1α分泌的影響：a: mRNA表達；b:蛋白表達圖2 PGN和苯并芘體外對人SZ95皮脂腺細胞IL-1β分泌的影響：a:mRNA表達；b:蛋白表達

圖3 PGN和苯并芘體外對人SZ95皮脂腺細胞TNF-α分泌的影響：a:mRNA表達；b:蛋白表達

3 討論

氯痤瘡、油痤瘡、及吸煙者痤瘡等痤瘡亞型均證實了環境污染物與痤瘡之間存在密切的關聯。對于這些亞型機制的研究集中于環境污染物對毛囊干細胞分化紊亂上，二噁英誘導的氯痤瘡、煤焦油誘導的油痤瘡及香煙中苯并芘都是芳香烴受體(AhR)的配體。AhR被激活后，皮脂腺細胞的增殖、生長周期、凋亡、脂質合成等生物學功能發生改變，近年來先后發現二噁英和苯并芘都可能通過AhR信號通路誘導人皮脂腺細胞的異常分化[8,9]。苯并芘誘導皮脂腺細胞AhR依賴性產生炎癥因子IL-6[9]。但環境污染物是否對尋常痤瘡產生影響的研究較少。最近有研究報道北京大氣污染物中的NO2, PM10和PM2.5濃度與皮脂分泌量、痤瘡皮損數目及皮膚科痤瘡患者門診就診率相關[4]，顯示環境污染可能在尋常痤瘡發病中起到重要作用。

痤瘡的炎癥反應是痤瘡發病機制中的重要一環，促炎癥因子IL-1 α等表達增加不僅能導致毛囊皮脂腺導管角化過度，也能夠誘導級聯產生更多的炎癥因子如IL-6、TNF-α及GM-CSF[5,10]。痤瘡丙酸桿菌是導致痤瘡炎癥發生的重要因素之一，PGN是革蘭氏陽性細菌細菌壁，參與痤瘡發生并常被用于體外痤瘡炎癥模型刺激物。本研究采用PGN刺激皮脂腺細胞構建皮脂腺細胞炎癥模型，發現PGN對皮脂腺細胞有明顯的促炎作用，分泌IL-1α，IL-1β,TNF-α等炎癥因子，并在代表性環境污染物AhR配體苯并芘的協同作用下，炎癥因子出現協同性增加，說明環境污染物可能加重了PGN誘導的炎癥反應，這可能是痤瘡發生或者加重的因素之一，AhR通路在腸道與呼吸道等研究上都證實了與TLR之間存在交聯[11,12],因此我們推測苯并芘可能是作用于TLR2信號通路中的某一個靶位，進而增強PGN對TLR2信號通路的刺激。

總之，我們初步的研究顯示環境污染物苯并芘與PGN協同刺激誘導了人皮脂腺細胞炎癥因子的釋放，顯示污染物可能會通過增強或者誘發痤瘡的炎癥反應導致病程的加重。但苯并芘和PGN協同刺激皮脂腺細胞產生炎癥因子的具體分子機制，仍有待進一步研究。

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