白細胞介素增強因子3對胃癌細胞侵襲轉移能力的影響及機制

劉羽，李勇，趙雪峰，檀碧波，賈楠，張萌，王冬

（河北醫科大學第四醫院 1.外三科，2.肝膽外科，河北 石家莊050011）

臨床胃癌患者多處于進展期，就診時往往已存在局部轉移甚至遠處轉移。胃癌細胞具有較強的侵襲和遷移能力，這是導致胃癌轉移的重要原因[1-2]。因此，尋找在胃癌侵襲轉移過程中發揮重要調控功能的基因對于抑制腫瘤細胞遷移、延緩腫瘤進展有益。白細胞介素增強因子3（interleukin enhancer-binding factor 3，ILF3）是近年來發現的與生理及病理狀態有關的新基因，研究顯示一些疾病中ILF3表達異常[3-5]，但ILF3在胃癌轉移中的作用及機制迄今報道極少。故本研究通過對臨床組織及胃癌細胞株的研究，探討了ILF3基因與胃癌侵襲轉移的關系，并對其中的分子機制進行了初步分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年1月-2015年12月，于河北醫科大學第四醫院確診并行手術治療的胃癌患者112例為研究對象。其中，男性74例，女性38例；年齡34～81歲，平均（56.38±8.79）歲。所有患者均經手術切除原發腫瘤。患者術前未經過放化療及生物治療。取患者的腫瘤原發灶石蠟標本連續4μm切片用于免疫組織化學檢測。另于患者中取62例陽性淋巴結轉移者的淋巴結及50例癌旁正常胃黏膜的石蠟標本進行免疫組織化學檢測。

1.2 細胞株及主要試劑

人胃癌高分化細胞株MKN28、中分化胃癌細胞株SGC7901、低分化胃癌細胞株BGC823、MGC803取自本院科研中心；胃上皮細胞株GES-1購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。LipofectamineTM2000轉染試劑為美國Invitrogen公司產品；改良杜氏伊格爾培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清為美國Gibco公司產品；噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、Trizol、 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒、蛋白提取試劑盒為美國Sigma公司產品；各基因的引物及ILF3-siRNA由上海生工公司設計合成。ILF3、基質金屬蛋白酶 7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶抑制劑 1（matrix metallo-proteinase inhibitor-1， TIMP-1）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體為美國Santa Cruz公司產品。

1.3 方法

1.3.1 SP法檢測胃癌組織、癌旁組織、轉移淋巴結組織中ILF3蛋白的表達 臨床標本石蠟組織脫蠟水化，進行SP染色。操作步驟嚴格按照免疫組織化學試劑盒說明書操作。結果判斷由2位病理專業人員盲法觀察切片結果，切片均隨機取5個400倍視野，每視野計數100個細胞。ILF3、MMP-7、MMP-9、TIMP-1蛋白以細胞質或細胞膜出現黃色或棕色染色為陽性。采用2次計分法計算陽性率：①按染色強度進行計分：無色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，褐色計為3分；②按陽性細胞比例計分：無陽性細胞計為0分，陽性細胞率＜10%計為1分，陽性細胞率11%～50%計為2分，陽性細胞率51%～75%計為3分，陽性細胞率＞75%計為4分。細胞染色強度及陽性細胞比例兩者相乘，結果≤2為陰性（-），結果＞2為陽性（+）。

1.3.2 胃癌細胞株及胃上皮細胞株培養 人胃癌細胞株MKN28、SGC7901、MGC803及胃上皮細胞株GES-1于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中常規培養，取生長期細胞進行實驗。

1.3.3 ILF3-siRNA轉染 ILF3-siRNA序列：5'-GCG GAUCCGACUACAACUACG-3'；無關對照siRNA序列：5'-CGGCUGCAAUCGAUUGAUAGC-3’。轉染前將MGC803細胞按4×105個/ml接種于6孔板中24 h，用無血清無抗生素的DMEM清洗細胞，按照轉染試劑LipofectamineTM2000試劑說明書，將siRNA轉染胃MGC803細胞，ILF3-siRNA濃度為40μmol/L。轉染24 h后，檢測轉染效果。

1.3.4 MTT法檢測細胞活性 MGC803細胞以5×104個/ml接種于96孔板，生長至70%～80%時轉染ILF3-siRNA或control siRNA。每組設6個復孔，培養20 h后加入20μl（5 mg/ml）的MTT，繼續培養4 h，棄去培養液，各孔加入150μl DMSO，室溫振蕩15 min，用酶標儀于波長490 nm測吸光度值（A值）。實驗重復3次。

1.3.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 MGC803細胞消化制成單細胞懸液，調節濃度為1×106個/ml接種至6孔板，細胞生長至60%～70%時分別轉染ILF3-siRNA或對照siRNA。待細胞生長至100%后棄去培養液，以PBS沖洗。無菌槍頭在6孔板底部劃痕，PBS洗去刮下的細胞，鏡下觀察傷口愈合情況。實驗重復3次。

1.3.6 Transwell小室侵襲實驗 Transwell小室上室用100μl Matrigel膠包被，紫外線照射。將消化好的MGC803細胞以1×106個/ml的濃度接種于6孔板，細胞生長至60%～70%時分別轉染ILF3-siRNA或對照siRNA。繼續培養24 h，各組分別取200μl細胞接種于Transwell小室上室，在下室加入DMEM培養基。24 h后以棉棒拭去上室的Matrigel膠和多余MGC803細胞，甲醇固定10 min，以結晶紫染色后計數穿膜的細胞數。實驗重復3次。

1.3.7 qRT-PCR檢測增殖和遷移侵襲相關基因mRNA表達 一步法提取MGC803細胞的總RNA，鑒定RNA的完整性、純度及含量。取2μg總RNA逆轉錄為cDNA。進行qRT-PCR反應檢測ILF3、MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因的mRNA相對表達水平，采用2-ΔΔCt法進行計算。各引物序列如下。ILF3：5'-GTGTCCAATCACCAGTCCTG-3'，5'-GCTGAAGAA GTGGGAGTGTAGC-3'；MMP-7：5'-GCTGACATCATGA TTGGCTTT-3'，5'-TCTCCTCCGAGACCTGTCC-3'；MMP-9：5'-TCTTCCAAGGCCAATCCTAC-3'，5'-ATCA CCGTCGAGTCAGCTC-3'；TIMP-1：5'-ACTTCCACAGG TCCCACAAC-3'，5'-GCATTCCTCACAGCCAACAG-3'；GAPDH ：5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3'，（R）5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。

Western blot檢測 ILF3、MMP-7、MMP-9、TIMP-1蛋白表達：提取樣本的總蛋白，應用Bradford法蛋白定量后，各樣本取40μg檢測。十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，電轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用TBST緩沖液配制的5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，分別加入稀釋好的各一抗抗體。4℃孵育過夜，用TBST緩沖液漂洗3次，加入辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗在室溫下孵育1 h，化學發光法（Chemiluminescence，ECLA）顯色，對條帶進行吸光度掃描，以目的蛋白與內參蛋白的比值代表目的蛋白的表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較應用SNK-q檢驗；計數資料以率或百分比表示，應用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ILF3在胃癌組織、癌旁組織、轉移淋巴結組織中的表達

免疫組織化學檢測（IHC）結果顯示，ILF3蛋白在轉移淋巴結陽性率最高80.65%（50/62），在胃癌組織中次之64.29%（72/112），在癌旁組織中陽性率最低24.00%（12/50），3組陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 胃癌組織、癌旁組織、轉移淋巴結組織中ILF3蛋白表達情況 （IHC ×400）

2.2 胃癌組織ILF3蛋白表達與臨床病理特征的關系

結果發現，腫瘤浸潤較深、分化程度低、淋巴結轉移及TNM分期不同的ILF3蛋白陽性率差異有統計學意義（χ2=7.169、4.865、7.009和6.728，P=0.007、0.027、0.008和0.010）。其他病理參數的ILF3蛋白表達情況差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 胃癌組織ILF3蛋白表達與臨床病理特征的關系 例

2.3 不同細胞株中ILF3蛋白表達情況

Western blot結果顯示，ILF3蛋白在4株胃癌細胞株表達均高于胃上皮細胞株GES-1，差異有統計學意 義（t=10.196、9.277、6.969和 4.812，P=0.000、0.000、0.002和0.009），在MGC803中ILF3蛋白表達最強。故選擇MGC803細胞為后續實驗材料。見表2、圖2。

表2 不同細胞株中ILF3蛋白表達的相對強度（n=3，±s）

表2 不同細胞株中ILF3蛋白表達的相對強度（n=3，±s）

注：?與GES-1比較，P＜0.05

不同細胞株 ILF3蛋白強度BGC823 1.012±0.092?MGC803 1.142±0.131?MKN28 0.785±0.084?SGC7901 0.624±0.068?GES-1 0.381±0.055

圖2 不同細胞株中ILF3蛋白表達情況

2.4 ILF3-siRNA轉染對MGC803細胞ILF3表達的影響

Western-blot結果顯示，以40μmol/L轉染MGC803細胞48 h后，細胞中ILF3蛋白表達低于對照組及空白組，差異有統計學意義（F=20.494，P=0.002；對照組與空白組q=-2.687，對照組與ILF3-siRNA組q=6.144，空白組與ILF3-siRNA組q=8.831）。見表3、圖3。

表3 干預后各組ILF3蛋白表達的相對強度（n=3，±s）

表3 干預后各組ILF3蛋白表達的相對強度（n=3，±s）

注：?與對照組及空白組比較，P＜0.05

組別 ILF3蛋白強度對照組 0.644±0.084空白組 0.686±0.072 ILF3-siRNA組 0.328±0.041?

圖3 ILF3-siRNA對MGC803細胞ILF3蛋白表達的影響

2.5 ILF3-siRNA轉染對MGC803細胞活性的影響

40μmol/L轉 染 MGC803細 胞 48 h后，ILF3-siRNA組細胞活性（0.426±0.062）低于對照組（0.778±0.079）及空白組（0.792±0.081），3組比較差異有統計學意義（F=56.369，P=0.000；對照組與空白組q=-2.495，對照組與ILF3-siRNA組q=11.576，空白組與ILF3-siRNA組q=14.071）。見表4、圖4。

表4 干預后各組細胞活性情況 （n=6，±s）

表4 干預后各組細胞活性情況 （n=6，±s）

注：?與對照組及空白組比較，P＜0.05

組別 細胞活性對照組 0.778±0.079空白組 0.792±0.081 ILF3-siRNA 組 0.426±0.062?

圖4 ILF3-siRNA轉染對MGC803細胞活性的影響

2.6 ILF3-siRNA轉染對MGC803細胞侵襲遷移能力的影響

ILF3-siRNA轉染MGC803細胞后，劃痕實驗發現轉染ILF3-siRNA的MGC803細胞遷移能力明顯低于對照組和空白組，3組比較差異有統計學意義（F=75.713，P＜0.05；對照組與空白組q=0.027，對照組與ILF3-siRNA組q=15.085，空白組與ILF3-siRNA組q=15.058）。Transwell小室實驗發現轉染ILF3-siRNA的MGC803細胞侵襲能力低于對照組和空白組，3組比較差異有統計學意義（F=52.771，P＜0.05；對照組與空白組q=-3.001，對照組與ILF3-siRNA組q=10.810，空白組與ILF3-siRNA組q=13.812）。見表5。

2.7 ILF3-siRNA轉染對MGC803細胞MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因表達的影響

以40μmol/L轉染MGC803細胞48 h后，MMP-7、MMP-9基因mRNA和蛋白表達下調，而TIMP-1基因mRNA和蛋白的表達上調（P＜0.05）。對照組與空白組各基因表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

表5 ILF3-siRNA轉染對MGC803細胞侵襲遷移能力的影響 （n=6，±s）

表5 ILF3-siRNA轉染對MGC803細胞侵襲遷移能力的影響 （n=6，±s）

注：?與對照組及空白組比較，P＜0.05

組別 劃痕實驗結果 Transwell小室侵襲實驗結果ILF3-siRNA組 22.17±2.23? 13.33±1.97?對照組 39.50±4.04 25.17±2.79空白組 40.67±2.58 26.50±3.02

圖5 ILF3-siRNA轉染對胃癌MGC803細胞MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因表達的影響

3 討論

胃癌患者的預后較差，目前進展期胃癌患者5年生存率低于40%[6]。雖然胃癌的診治技術已取得了很大進展，但胃癌治療的遠期效果改善依然不能令人滿意。胃癌預后差的重要原因在于胃癌細胞有較強的侵襲及遷移能力[7]，這種能力使胃癌早期即可發生轉移；而且在轉移過程中腫瘤細胞還會發生進一步變化[8]，導致治療措施失效，從而成為胃癌復發及進一步轉移的原因。因此，確定在胃癌侵襲轉移中發揮重要的基因對胃癌綜合診治有重要意義。ILF3是近年來發現的與腫瘤關系密切的新基因。有研究發現ILF3/p21通路與調控細胞周期有關，從而參與B細胞慢性淋巴細胞白血病的進展[9]。還有研究發現ILF3基因編碼的NF90蛋白對周期素E1（Cyclin E1）有直接調控作用，可以通過調節細胞周期而參與肝細胞癌的增殖[10]。本研究發現，胃癌組織中ILF3蛋白的表達比正常胃黏膜明顯增強，且與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移情況有關，提示ILF3蛋白可能在胃癌的進展中發揮了作用。研究還發現轉移淋巴結組織中ILF3蛋白表達陽性率高于原發灶，說明ILF3蛋白可能在腫瘤轉移過程中通過增強表達促進胃癌的轉移。

為了解ILF3基因在胃癌細胞侵襲轉移中發揮的作用，本研究進行了體外實驗。通過Western blot篩選，發現低分化黏液腺癌來源的MGC803細胞中ILF3蛋白表達最強，故進一步研究中對MGC803細胞的ILF3基因進行了抑制。結果發現，MGC803細胞中內源性ILF3基因受到抑制后腫瘤細胞的活性減弱，侵襲遷移能力也降低。說明ILF3基因在胃癌細胞的侵襲遷移過程中發揮了促進作用，抑制ILF3基因表達可能抑制腫瘤進展。

為初步了解ILF3基因參與胃癌侵襲遷移的機制，本研究檢測了抑制ILF3基因前后腫瘤侵襲遷移相關基因MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因的表達變化。MMPs-TIMPs是影響腫瘤侵襲轉移的重要基因家族，MMP-7、MMP-9、TIMP-1是其中重要成員，MMP-7、MMP-9對促進胃癌細胞的侵襲遷移有重要作用，而TIMP-1則具有抑制MMP-9等基因的作用[11-14]。本研究顯示，抑制MGC803細胞中ILF3表達后細胞的MMP-7、MMP-9表達降低，而TIMP-1的表達升高，提示胃癌細胞中ILF3基因可能通過調節MMP-7、MMP-9、TIMP-1參與了胃癌細胞的侵襲轉移過程，但深入的分子機制還有待深入研究。

[1]YANG Z G,GAO L,GUO X B,et al.Roles of long non-coding RNAs in gastric cancer metastasis[J].World J Gastroenterol,2015,21(17): 5220-5230.

[2]SHI Z,WEI Q,SHE J.MicroRNAs in gastric cancer metastasis[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr,2014,24(1): 39-53.

[3]CASTELLA S,BERNARD R,CORNO M,et al.Ilf3 and NF90 functions in RNA biology[J].Wiley Interdiscip Rev RNA,2015,6(2): 243-256.

[4]LI Y,MASAKI T,SHIMAKAMI T,et al.hnRNP L and NF90 interact with hepatitis C virus 5’-terminal untranslated RNA and promote ef fi cient replication[J].J Virol,2014,88(13): 7199-7209.

[5]WEN X,HUANG X,MOK BW,et al.NF90 exerts antiviral activity through regulation of PKR phosphorylation and stress granules in infected cells[J].J Immunol,2014,192(8): 3753-3764.

[6]LI Y,ZHAO Q,FAN L Q,et al.Analysis of lymph node dissection range-related factors for early gastric cancer operation[J].Hepatogastroenterology,2013,60(125): 971-974.

[7]WANG J,QU J,LI Z,et al.A prognostic model in metastatic or recurrent gastric cancer patients with good performance status who received fi rst-line chemotherapy[J].Transl Oncol,2016,9(3): 256-261.

[8]LI Y,TAN B B,FAN L Q,et al.Heterogeneity for COX-2,multidrugs resistance between primary tumors and regional lymph node metastases of gastric cancer[J].Tumori,2012,98(4): 516-522.

[9]AGNOLETTO C,BRUNELLI L,MELLONI E,et al.The antileukemic activity of sodium dichloroacetate in p53mutated/null cells is mediated by a p53-independent ILF3/p21 pathway[J].Oncotarget,2015,6(4): 2385-2396.

[10]JIANG W,HUANG H,DING L,et al.Regulation of cell cycle of hepatocellular carcinoma by NF90 through modulation of cyclin E1 mRNA stability[J].Oncogene,2015,34(34): 4460-4470.

[11]SUI H,XU H,JI Q,et al.5-hydroxytryptamine receptor(5-HT1DR) promotes colorectal cancer metastasis by regulating Axin1/β-catenin/MMP-7 signaling pathway[J].Oncotarget,2015,6(28): 25975-25987.

[12]MERDAD A,KARIM S,SCHULTEN H J,et al.Expression of matrix metalloproteinases (MMPs) in primary human breast cancer: MMP-9 as a potential biomarker for cancer invasion and metastasis[J].Anticancer Res,2014,34(3): 1355-1366.

[13]AN H J,LEE Y J,HONG S A,et al.The prognostic role of tissue and serum MMP-1 and TIMP-1 expression in patients with nonsmall cell lung cancer[J].Pathol Res Pract,2016,212(5): 357-364.

[14]FAN H,JIANG W,LI H,et al.MMP-1/2 and TIMP-1/2 expression levels,and the levels of collagenous and elastic fi bers correlate with disease progression in a hamster model of tongue cancer[J].Oncol Lett,2016,11(1): 63-68.