Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者外周血中的表達及臨床意義

陳國飛，楊華，蔣幸新，王波，徐艷

（1.江蘇省蘇州市中西醫結合醫院 檢驗科，江蘇 蘇州 215000；2.江蘇省蘇州市中西醫結合醫院 內四科，江蘇 蘇州 215000；3.江蘇省蘇州市吳中人民醫院 內科，江蘇 蘇州 215128）

胃癌是世界上最為普遍的惡性腫瘤之一，在全球范圍內，每年約有70萬人死于胃癌，位居所有腫瘤的第2位[1]。在我國胃癌發病率遠高于西方國家，是我國發病率第2高的惡性腫瘤，死亡率也高居第3位[2-3]。胃癌患者預后較差，大部分患者初次就診時腫瘤已處于晚期或發生轉移[3]。因此，胃癌的5年生存率僅為40%左右，其中大約5%的胃癌患者發生遠處器官轉移[4-6]。近年來，隨著診治水平的提高，胃癌的發病率在全球范圍內逐步下降，但如何提高胃癌的早期診斷率及改善胃癌患者的術后生活質量仍是全球性的科研難點和熱點。

Survivin是近年來發現的凋亡蛋白抑制分子，在多種惡性腫瘤中廣泛表達，與腫瘤的惡性表型及不良預后密切相關[7-8]。CK19片段CYFRA 21-1也被證實是乳腺癌[9]、非小細胞肺癌[10-11]和結腸癌[11]等多種腫瘤的血清診斷標志物。但胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的診斷和預后價值目前尚未得到充分研究。本研究擬通過RT-PCR檢測胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達水平，并聯合分析Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌早期診斷和判斷預后中的臨床意義，為胃癌早期診斷和個體化治療尋找有效分子指標以及奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象 2007年5月-2010年12月于蘇州市中西醫結合醫院就診的胃癌患者89例以及同期健康對照89例，所有入選患者的臨床病理資料完整。病例納入標準如下：①經病理組織學確診為胃癌，且均為初診初治患者；②入組患者術前均未接受放、化療及生物治療；③入組患者肝腎功能未見明顯異常；④未合并其他腫瘤或嚴重內科疾病。入組患者術前空腹采血5 ml，枸櫞酸鈉抗凝去酶的采血管中保存。經本院倫理委員會批準，所有入選本課題的胃癌患者均同意使用其外周血標本用于科學研究并簽署知情同意書。

1.1.2 實驗試劑和儀器 Survivin和CK19引物由上海吉瑪科技有限公司合成，血液總RNA試劑盒購自北京天根科技有限公司，RNA逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，SYBR Premix試劑盒購自TaKaRa公司；主要儀器如下：美國Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀，Thermo公司 -80℃冰箱，海爾公司-20℃冰箱，德國Eppendorf公司臺式低溫高速離心機。

1.2 外周血Survivin mRNA和CK19 mRNA的提取及逆轉錄

外周血總RNA提取方法參照北京天根科技有限公司的血液總RNA提取試劑盒所述步驟。紫外分光儀檢測RNA濃度及純度。逆轉錄步驟參照TaKaRa逆轉錄試劑盒所述步驟，每個逆轉錄體系中含有10 ng的RNA模板。逆轉錄條件為：30℃ 10 min，42℃50 min，95℃ 5 min，反應產物儲存于-20℃冰箱備用。

逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）條件為：95℃5 min，94℃ 30 s，72℃ 60 s，循環40次，最后72℃5 min， Survivin mRNA復性溫度62℃30s，CK19 mRNA復性溫度63℃ 30 s。采用相對定量法計算外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的相對表達量（F），F=2-ΔCt，ΔCt=Ct miR-17-5p-CtU6，Ct為每個反應管熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，采用Speraman相關分析，外周血Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者中的診斷價值采用ROC曲線，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，各組間生存差異比較采用Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Survivin和CK19在胃患者外周血中的表達

RT-PCR結果顯示，健康對照中Survivin的表達水平為（1.871±1.317），胃癌患者外周血中Survivin表達水平為（8.131±4.182），經t檢驗，差異有統計學意義（t=7.195，P=0.019）；健康對照中CK19的表達水平為（1.018±0.819），胃癌患者外周血中CK19表達水平為（13.256±7.518），經t檢驗，差異有統計學意義（t=12.013，P=0.003）。89例胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達水平均高于健康對照組。見圖1。

圖1 胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達水平

2.2 外周血Survivin mRNA和CK19 mRNA的診斷價值

根據89例胃癌患者和健康對照外周血中Survivin和CK19 mRNA的表達水平分別繪制ROC曲線。結果顯示，Survivin的ROC曲線下面積為0.8305（95%CI：0.784，0.887），敏感性為78.151%，特異性為85.394%，對應診斷界值為7.875（圖2A）；CK19的ROC曲線下面積為0.8149（95%CI：0.761，0.899），敏感性為73.157%，特異性為81.825%，對應診斷界值為8.114（圖2B）。兩者聯合檢測并聯試驗可提高敏感性至92.136%，串聯實驗可提高特異性之97.751%，高于任一單一指標的檢測，提示外周血中的Survivin mRNA和CK19 mRNA表達水平在胃癌患者中均具有較高的診斷價值。

圖2 胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的診斷價值

2.3 外周血Survivin mRNA的表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關系

χ2檢驗顯示，外周血Survivin mRNA的表達與胃癌患者的TNM分期正相關，組間差異有統計學意義（P＜0.05），隨著TNM分期的進展，外周血中Survivin mRNA的表達水平亦逐漸升高。而外周血Survivin的表達與患者的年齡、性別、Lauren分型等臨床病理特征無相關。見表1。

2.4 外周血CK19 mRNA的表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關系

χ2檢驗顯示，外周血CK19 mRNA的表達與胃癌患者的TNM分期正相關，組間差異有統計學意義（P＜0.05），隨著TNM分期的進展，外周血中CK19 mRNA的表達水平亦逐漸升高。而外周血CK19 mRNA的表達水平與患者的年齡、性別、Lauren分型等臨床病理特征無相關。見表2。

2.5 外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA表達水平與胃癌患者術后5年生存率的關系

根據外周血中Survivin mRNA表達水平，將胃癌患者分為Survivin高表達組和Survivin低表達組。Kaplan-Meier生存曲線顯示，Survivin高表達組的胃癌患者的術后5年總體生存率低于Survivin低表達組（P＜0.05）。而后，根據外周血中CK19 mRNA表達水平，將胃癌患者分為CK19高表達組和CK19低表達組。Kaplan-Meier生存曲線顯示，CK19高表達組的胃癌患者的術后5年總體生存率低于CK19低表達組（P＜0.05）。最后，根據胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達水平，將胃癌患者分為Survivin+CK19+組、Survivin+CK19-組、Survivin-CK19+組和Survivin-CK19-組，利用K-M曲線分析4組胃癌患者術后5年生存率的差異，結果顯示，Survivin+CK19+組胃癌患者術后5年生存率低于其他各組，Survivin-CK19-組胃癌患者術后5年生存率高于其他各組（P＜0.05）。見圖3。

表1 外周血Survivin mRNA表達水平與89例胃癌患者臨床病理因素的關系 例

表2 外周血CK19 mRNA表達水平與89例胃癌患者臨床病理因素的關系 例

圖3 胃癌患者外周血中Survivin mRNA和/或CK19 mRNA表達與患者術后5年生存率的關系

3 討論

循環腫瘤細胞是腫瘤轉移和復發的元兇，檢測腫瘤患者外周血中的循環腫瘤細胞有助于動態監測腫瘤治療效果及預測預后。Survivin是近年來發現的凋亡抑制蛋白，定位于17q25染色體，其特異性地高表達于腫瘤組織，與腫瘤發生及進展密切相關[12]。CK19是國內外應用最廣泛的檢測上皮來源腫瘤患者外周血循環腫瘤細胞表達情況的生物標志物[12]。Survivin和CK19是常用的循環腫瘤細胞的鑒定標志物。本研究利用RT-PCR檢測了Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者外周血的表達水平，并進一步研究了Survivin mRNA和CK19 mRNA與胃癌患者早期診斷、臨床病理特征和術后生存率之間的關系。本研究顯示胃癌患者外周血中Survivin mRNA的表達水平高于健康對照組，提示了Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌早期診斷中的潛在價值。因此，利用ROC曲線進一步檢測Survivin mRNA和CK19 mRNA的診斷價值，結果顯示Survivin mRNA和CK19 mRNA均為胃癌早期診斷的有效分子指標。更為重要的是，聯合檢測Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者外周血中表達可進一步提高胃癌早期診斷的敏感性或特異性，可避免單一檢測帶來的假陽性和假陰性等局限性。

研究證實，胃癌患者腹腔灌洗液中Survivin的表達水平與胃癌患者腫瘤浸潤深度、淋巴轉移和TNM分期密切相關[13]。而關于CK19與胃癌臨床病理特征的關系目前尚存在爭議。既往研究采用RT-PCR檢測胃癌患者外周血中CK19 mRNA在胃癌中的表達及臨床意義，發現CK19 mRNA與胃癌患者的年齡、性別和TNM分期等病理特征無相關[14]。另有研究利用免疫熒光法檢測CK19在外周血中的表達表達，研究發現外周血中CK19的表達與淋巴結轉移、遠處轉移和復發密切相關，而與性別、年齡、腫瘤部位、TNM分期和腫瘤分化程度無關。然而本研究顯示Survivin mRNA和CK19 mRNA與胃癌患者的TNM分期呈正相關[15]。各實驗結果差異的可能原因為實驗方法敏感性和特異性的差異以及不同的病例群。為了進一步明確胃癌患者外周血中CK19與胃癌患者臨床病理特征的關系，急需進一步的大病例群前瞻性研究。

既往研究顯示，外周血CK19 mRNA陽性的患者術后5年生存率低于CK19 mRNA陰性組[14]，且CK19陽性或Survivin陽性的循環腫瘤細胞與胃癌患者的預后密切相關，是判斷胃癌患者預后和復發獨立的分子指標[16-17]。值得注意的是，也有研究報道CK19 mRNA的表達水平與胃癌患者預后并無相關[18]。為了進一步明確外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達水平與胃癌患者預后的關系，本研究進一步分析了2者單獨和聯合檢測在胃癌患者預后判斷中的價值。本研究結果證實Survivin mRNA和/或CK19 mRNA陽性的胃癌患者術后5年生存率低于Survivin mRNA和/或CK19 mRNA陰性組。更為重要的是，聯合分析2者表達與胃癌術后5年生存率的關系顯示，Survivin+CK19+組胃癌患者術后5年生存率低于其他各組，Survivin-CK19-組胃癌患者術后5年生存率高于其他各組，提示聯合檢測2者表達水平更有助于判斷胃癌患者預后并制定個體化治療方案。

綜上所述，本研究證實了胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA表達高于健康對照組；外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA均為有效的胃癌早期診斷的分子指標；外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達水平與胃癌的TNM分期呈正相關，而與年齡、性別、及Lauren分型等臨床病理特征無相關；Survivin+CK19+組胃癌患者術后5年生存率低于其他各組，Survivin-CK19-組胃癌患者術后5年生存率高于其他各組。本研究為胃癌發生及進展的基礎研究奠定了一定的前期基礎，為胃癌的早期診斷及個體化治療提供了潛在的分子靶點。

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