ApoE基因多態性與血脂、氧化低密度脂蛋白、糖尿病足的相關性分析*

葉炳華+孫筱曄+蔣澤+戚文群+唐寶康+倪云

【摘要】 目的：評價載脂蛋白E（ApoE）基因多態性與血脂、氧化低密度脂蛋白（oxLDL）及2型糖尿病（T2DM）患者發生糖尿病足（DF）的相關性，為DF的早期基因診斷提供循證醫學的證據。方法 應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性檢測70例T2DM患者（40例DF患者，30例無慢性并發癥患者）和48例健康對照者的ApoE基因多態性，比較T2DM患者中并發DF（DF組）與無慢性并發癥DM（DM對照組）患者及健康組的ApoE基因型分布和等位基因頻率，并利用Logisitic回歸分析ApoE基因多態性與DF之間的相關性。結果： DF組ε3/4基因型和ε4等位基因均高于其他兩組；ε2/4、ε3/4兩組TCH、LDL、oxLDL、HbA1C均明顯高于ε2/3、ε3/3兩組，HDL則低于上述兩組；各等位基因之間比較：ε4組TCH、LDL、oxLDL、HbA1C均顯著高于ε2、ε3兩組，ε2組TG明顯高于ε3、ε4兩組；ε3/4基因型和ε4等位基因與發生DF明顯相關。結論 ApoE基因多態性與T2DM患者DF的發生相關，基因型ε3/4和等位基因ε4可能是T2DM患者并發DF的危險因子，其機制可能通過血脂代謝紊亂及促進脂質氧化而影響DF的發生。

【關鍵詞】 載脂蛋白E； 糖尿病足； 血脂； 氧化低密度脂蛋白； 2型糖尿病

【Abstract】 Objective：To investigate the association of apolipoprotein E（ApoE） gene polymorphism with diabetic foot（DF） in patients with type 2 diabetes mellitus（T2DM） and hyperlipidemia（LDL），and to provide the evidence of evidence-based medicine for early gene diagnosis of DF.Method：Firstly，polymorphism of ApoE gene was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP） in 70 T2DM patients（40 with DF while 30 without chronic complications） and 48 healthy controls.Secondly，ApoE genotype distribution and allele frequency of DF（DF group） and non-chronic complications DM（DM control group） patients and health group control group were investigated.Correlation between ApoE gene polymorphism and DF was also analyzed with logistic regression analysis.Result：ε3/4 genotype andε4 allele in DF group were significantly higher than those in the other two groups（P<0.05）.Besides HDL，the levels of TCH，LDL，oxLDL and HbA1c in ε2/4 and ε3/4 were significantly higher than those in ε2/3 and ε3/3（P<0.05）.The levels of TCH，LDL，oxLDL and HbA1c inε4 were significantly higher than those in ε2 and ε3，while the level of TG in ε2 was significantly higher than that in ε3 and ε4（P<0.05）.ε3/4 genotype and ε4 allele were significantly associated with DF.Conclusion：ApoE gene polymorphism is associated with the occurrence of DF in T2DM patients.Genotype ε3/4 and allele ε4 are risk factors probably for DF in T2DM patients.The mechanism may be related to lipid metabolism disorder and lipid oxidation.

【Key words】 Apolipoprotein E； Diabetic foot； Lipid； Oxidized low-density lipoprotein； Type 2 diabetes mellitus

First-authors address：Taizhou Third Peoples Hospital，Taizhou 225321，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.013

載脂蛋白E（ApoE）基因具有明顯的遺傳多態性，ApoE基因多態性已被證實是冠心病的易患因素[1-2]。氧化低密度脂蛋白（oxLDL）亦被認為是冠心病、動脈硬化（AS）的發病機制之一[3]。近年來不少研究證實，ApoE基因多態性與冠心病、腦梗死、糖尿病（DM）伴腎病也密切相關[4-6]，但與oxLDL、糖尿病足（DF）是否相關尚少見報道。本研究通過分別檢測DF患者、無慢性并發癥DM患者以及健康對照者的ApoE基因多態性、oxLDL，研究兩者之間及與2型糖尿病（T2DM）患者發生DF的相關性，試圖從遺傳基因角度探討DF的早期發現及防治，現報告如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年2月-2015年12月選擇在本院就診的T2DM患者，根據DF（Wagner分級）[7]標準：并發有嚴重的周圍神經病變、自主神經病變和周圍血管病變，伴或不伴開放性損傷的DF。使用DF診斷箱選取并發DF患者40例，年齡36～82歲，病程4～21年；選擇無慢性并發癥患者30例為DM對照組，另外選擇門診體檢結果正常人員48例為健康對照組，所有對象常規檢查糖化血紅蛋白（HbA1c）、血脂、ApoE基因多態性及oxLDL。

1.2 方法

1.2.1 DF診斷箱 （1）采用8 MHz雙向多普勒儀檢查，同時配合踝肱及趾肱血壓組件（測量踝肱指數ABI，趾肱指數TBI），檢查外周血管的硬化、狹窄及阻塞狀況；（2）采用10 g尼龍絲觸覺檢查和局部針刺疼痛覺檢查，采用神經病變定量音叉、多功能叩診錘、涼溫覺檢查器、數字震動感覺閾值檢查儀檢查溫度和震動感覺閾，診斷多發性外圍感覺神經病變。

1.2.2 血液標本采集及檢測 所有研究對象均于空腹12 h采集靜脈血6 mL，4 mL進行臨床指標的檢測，2 mL置于-70 ℃低溫冰箱備檢基因型；ApoE基因型測定：采用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性方法（PCR-RFLP）檢測，具體方法：按常規方法提取DNA并進行PCR擴增，上游引物：5-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACA-3，下游引物：5-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3，由珠海賽樂奇生物技術有限公司設計并合成。PCR循環條件采用Touch Down程序：（1）94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共12個循環；（2）94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共20個循環。PCR產物經特異性限制性內切酶Hhal消化后，經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳6～8 h，溴化乙錠染色0.5 h后，出現4種ApoE基因型：ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4；oxLDL采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定，試劑盒由上海榮盛生物技術公司生產；HbA1c采用乳膠免疫抑制凝集法測定；血糖、血脂采用酶法由全自動生化分析儀（日立7600）測定。

1.3 統計學處理 利用Stata 10.0軟件包對數據進行處理，計數資料采用 字2檢驗或精確概率法，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，組間進行方差分析（ANOVA），然后應用S-N-K方法進行組間兩兩比較，采用Logisitic回歸進行相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ApoE基因多態性檢測結果 運用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）方法，共檢出ApoE4種常見基因型ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4；三種等位基因ε2、ε3和ε4。基因型以ε3/3最常見（61.0%），其次ε2/3（21.2%）、ε3/4（16.1%），ε2/4最少見（1.7%）；等位基因以ε3最常見（79.7%），其次ε2（11.4%），ε4最少見（8.9%）。

2.2 各組基因型和等位基因頻率比較 ApoEε3/3、ε3/4基因型和ε4等位基因頻率三組比較差異均有統計學意義（P

2.3 不同基因型和等位基因之間臨床指標比較 各基因型之間比較：ε2/4、ε3/4 TCH、LDL、oxLDL、HbA1c均明顯高于其他兩者，HDL低于其他兩者；各等位基因之間比較：ε4 TCH、LDL、oxLDL、HbA1c均顯著高于ε2、ε3，而HDL則明顯低于ε2、ε3，ε2 TG則明顯高于ε3、ε4，見表2。

2.4 DF與ApoE基因多態性的相關分析 以DF發生為因變量，選擇ApoE基因型或等位基因自變量作Logistic回歸，ApoEε3/4基因型[ 字2=8.25，P<0.05，95%CI（0.062～0.723）]和ε4[ 字2=6.02，P<0.05，95%CI（0.952～24.996）]與DF明顯相關。

3 討論

DF是指DM患者足部由于神經病變使下肢保護功能減退，大血管和微血管病變使動脈灌注不足致微循環障礙而發生潰瘍和壞疽的疾病狀態。DF是DM一種嚴重的慢性并發癥，是DM患者致殘致死的重要原因之一。DF之所以治療效果不理想、預后較差，一方面是由于它的發病機制涉及遺傳因素、環境因素、高血糖等多種致病因子，病理生理變化及臨床表現與其他動脈硬化閉塞性肢體疾病相比更為復雜，部分發病機制尚未完全明了[8]，另一個主要原因是沒有一種比較理想的檢測方法能夠早期準確的預測并給予相應早期處理。因此探討高危DF（DF-Wagner分級0級）的早期識別手段對于DF的預后具有重要意義。

人類ApoE基因具有顯著的遺傳多態性，ApoE基因的多態性已被證實是心血管病如冠心病的易患因素[9]。ApoE的重要生理功能是作為脂蛋白的配體與功能蛋白，參與脂質的肝臟代謝，尤其是致AS脂類如乳糜微粒殘基的代謝，從而影響冠心病的發病。

ApoE有3種等位基因ε2、ε3、ε4，構成常見的6種表型：即3種純合子（ε2/2、ε3/3、ε4/4）和3種雜合子（ε2/3、ε2/4、ε3/4），其中以ε3/3、ε2/3、ε3/4頻率為最高，ε2/2、ε2/4、ε4/4較少見。本研究ε3/3、ε3/4檢出率最高，未檢出ε2/2、ε4/4基因型，與張東平等報道基本相符[10-11]。

本研究結果顯示：攜帶ε4等位基因的ε2/4、ε3/4 TCH、LDL、oxLDL、HbA1c均明顯高于ε2/3、ε3/3，HDL低于上述兩者，等位基因ε2 TG明顯高于ε3、ε4，與既往文獻[12-13]資料基本吻合，提示ApoE基因多態性與血脂代謝、脂質氧化密切相關，ε4似有升高致AS膽固醇、促進脂質氧化作用，這與文獻[14-15]報道一致。ApoE基因多態性影響脂質代謝的機制比較復雜，其可能的機制為：（1）ApoE是LDL受體的配體，其主要功能是與肝細胞上LDL受體結合，使肝細胞吞噬脂蛋白并代謝內部的膽固醇，進而影響血脂代謝，由于APOE表型不同，與LDL受體結合的能力也不同，ε4與LDL受體結合活性明顯高于ε2，與ε3相似，機體可通過肝細胞ApoE受體吞噬較多的含ε4脂蛋白，使肝細胞游離膽固醇含量增加，引起肝細胞表面的LDL受體繼發性表達下調，從而導致LDL增加[16-17]；（2）ε4攜帶者小腸吸收膽固醇增加，因而血漿LDL水平較高[18]；（3）ε4等位基因與突變的LDL受體基因連鎖，導致外周組織LDL受體轉錄的下調，減慢LDL分解，從而提高血漿LDL水平[19]；（4）ε4誘導巨噬細胞功能障礙、細胞凋亡、線粒體異常并且促進炎癥反應[20]。

本研究結果顯示：DF組ε3/4基因型和ε4等位基因均高于DM對照組及健康對照組（P<0.05），而ε3/3基因型則低于其他兩組，Logistic回歸分析ApoEε3/4基因型和ε4與DF明顯相關（P<0.05），提示ApoEε3/4基因型和攜帶ε4等位基因的T2DM患者發生DF的危險性較其他基因型及攜帶其它等位基因的T2DM患者為高，ε4可能是T2DM患者并發DF的危險因子，其機制可能與上述影響脂質代謝作用有關。

本研究表明，ApoE基因多態性確實影響機體的血脂、脂蛋白及脂質過氧化水平，ε4等位基因以及攜帶ε4的ε2/4、ε3/4基因型與高TCH、LDL、氧化應激及DF的發生存在明顯關聯，這對于DF的早期識別及防治具有一定的指導意義。

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（收稿日期：2017-06-05） （本文編輯：程旭然）endprint