植物組織培養試驗要點小結

陳洪燕+沈鴻云+胡雙珍

摘 要：在無菌和人工控制的環境條件下，利用適當的培養基，對離體的植物器官、組織、細胞及原生質體進行培養，使其再生細胞或完整植株。

關鍵詞：植物組織培養；滅菌；接瓶；組培苗；移栽

中圖分類號：Q943.1 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180133052

樂昌每年種植香芋1334萬m2，馬蹄933.8萬m2，是農民種植的主要經濟作物之一，香芋和馬蹄都是通過留種無性繁殖，種性退化問題較為突出，抗病性和抗逆性減退，利用組織培養的方法解決品種退化問題，在許多園藝作物上都得到了成功應用，因此樂昌市農業科學研究所從今年3月開始研究植物組織培養技術，為日后組培香芋、馬蹄苗做準備。現就本所組培試驗要點小結如下。

1 外圍準備

碟子和所有器械清洗完畢后將水擦干，用報紙捆包好，再放滅菌鍋內滅菌。需滅菌的器械有：鑷子、剪刀、解剖刀，碟子（8個包一包），玻璃杯2個和紗布（紗布用手撕成小塊，不能用剪刀剪，否則用于擦試工作臺等容易留下剪刀口布屑）。

培養基可不經過煮制，將所有物質稱量好，瓊脂粉等需要溶解的物質溶解，之后混合定容調pH值，再倒入灌裝機分裝，分裝時需不停的攪拌培養基，灌裝時勿將培養基滴灑在瓶口，否則需用抹布擦干凈或換玻璃瓶。

滅菌鍋在消毒前先預熱，將夾層壓力上升，減少煮制時間，煮完后手動慢慢放氣（使濕熱蒸汽趁熱散去而不打濕防潮物）讓壓力下降，10min左右讓室內壓力降至0（避免悶鍋時間長導致培養基不凝固），后取出后趁熱迅速擰緊瓶蓋，待冷卻后移至緩沖室平放，使培養基平鋪在瓶底凝固。

外植體取材：取當年生萌動狀態的飽滿嫩枝芽作為外植體，先用5%洗衣粉浸泡5min，用刷子輕輕刷，用流水沖洗，時間視材料清潔程度而定，蒸餾水沖洗3～5次，可去除較多泥塵和微生物，最理想的清洗物質是表面活性物質～吐溫，之后將外植體切割成適當大小，滅菌容器能放入為宜，移至酒精擦試好的帶蓋無菌瓶子內，放入無菌操作臺備用。

2 內圍接瓶

將所有需要擺上無菌操作臺的東西用酒精擦試表面后擺好，需用酒精擦試的物品（包括：工作臺面，臺周圍玻璃和母瓶，新培養基瓶，酒精燈，擱置架，打火機等），母瓶和新培養基放左上方，酒精燈放左下方，身體正前方放碟子，右上方靠左放器械擱置架，右上方靠右放接種器械滅菌器，左下方放打火機和半瓶70%酒精，后開紫外燈20min，再通風20min后開始操作。

工作人員進入無菌接種室前，應先將手表、手鐲、戒子等放室外，將手和手腕用肥皂清洗干凈后，用酒精紗布擦拭雙手、雙腕，之后換工作服，包括更換拖鞋，穿白大褂，接種人員還要扎好頭發，戴好帽子和口罩，指甲需剪短，將手和手臂用酒精擦試后戴手套操作，在組培室內不得高聲喧嘩、打鬧，接種時不得隨意談話、說笑，以免造成污染，臺外人員走動要輕，動作要小。

打開無菌操作臺玻璃門之前先用酒精霧噴，使懸浮在無菌操作臺周圍的灰塵顆粒沉降，操作時將擱置架在酒精火焰上方灼燒一下，打開包裝好的碟子（注意手一定不能接觸碟子邊沿），鑷子、解剖刀從報紙取出后，先用酒精擦試一下，再放在酒精燈火焰上灼烤1遍（工具的每1點在火焰上灼烤時間不得少于5s），之后開始接（轉）苗。外植體的消毒用酒精和次氯酸鈉（鈣），最優消毒為：既有污染的，也有消毒好沒被污染的，也有褐化的。

取苗：瓶子在打開之前瓶口都需在火焰上灼燒7～10s，

正式取苗時，瓶口不要斜向外或直立向上，以免空氣中微生物落入瓶中。轉苗時一次取苗不可太多，以免風干。切苗：碟子放在離風窗10～20cm處，鑷子和手術刀不可太熱，在操作過程中，手要在碟子斜上方操作，不可在其正上方操作，更不能交叉過碟子上方操作，切苗過程中產生的垃圾堆放在碟子一側。注意操作操作人員的頭、胳膊等不得進入臺內。接苗：將未接瓶的培養基瓶口在酒精燈火焰上灼烤7～10s，烤完瓶口后再接苗，接苗時，鑷子不要與瓶口接觸，一瓶內一般接5～6棵苗，動作迅速，組培苗在瓶內排放均勻整齊，美觀。

封口、記錄，接好后用酒精火焰灼燒瓶口封口，后迅速蓋好瓶蓋扭緊。碟子1瓶母瓶用1個，用完之后用鑷子挑起拿開，接好的瓶苗隨手放到無菌操作臺外面推車上，工作過程中所產生的垃圾及時清理，防止交叉污染。下臺前把品種代號、培養基類型、個人編號以及接種日期標示到瓶上。接好后將工作臺擦試干凈，把接種過程中產生的垃圾清理掉，臺上的物品擺放整齊，用消毒粉兌水拖接種室和培養室地面，后開紫外燈照射。工作人員進出組培室隨手關門。培養室需密閉，避免蟲子進入，室溫控制在25℃左右，保證植物培養最適溫度。

3 滅菌

一經發現就隨即滅菌處理，大量的進行高壓鍋滅菌，少量的加入工業酒精在室外進行處理。室內空氣滅菌：每四周用高猛酸鉀和甲醛（或臭氧）對室內空氣滅菌1次。室內地面：每接種1次用消毒粉兌水拖一遍地面。

4 結語

通過組織培養試驗技術的研究，為日后本所香芋、馬蹄的組織培養提供參考數據和技術支持，為樂昌農民提供高質量香芋、馬蹄種苗，使農民獲得更大的經濟效益。