大黃素對海人酸致癇小鼠海馬iNOS和COX—2表達的影響

歐陽龍強+夏文燕+楊少春+鄒連生+婁建云+高志強

[摘要]目的 探討大黃素對海人酸誘導的小鼠癲癇持續狀態后海馬組織誘導型一氧化合酶（iNOS）、環氧化酶-2（COX-2）表達的影響。方法 選取45只ICR雄性小鼠，隨機分為對照組、癲癇持續狀態組、大黃素治療組，每組15只。采用海人酸建立小鼠癲癇模型，大黃素治療組腹腔注射200 mg/kg的大黃素。癲癇持續狀態組和對照組注入等量的生理鹽水。致癇24 h后通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察海馬神經細胞的形態學變化，采用RT-PCR、Western blot分別檢測iNOS、COX-2 mRNA與蛋白的表達。結果 大黃素可明顯改善癲癇鼠海馬組織的病理形態學變化；大黃素治療組iNOS、COX-2 mRNA與蛋白的含量明顯低于癲癇持續狀態組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 大黃素能降低小鼠癲癇持續狀態后海馬組織iNOS、COX-2 mRNA與蛋白的表達。

[關鍵詞]大黃素；癲癇；iNOS；COX-2

[中圖分類號] R742.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）1（b）-0011-04

[Abstract]Objective To investigate Emodin′s influence on the expression of iNOS，COX-2 in hippocampus of mice after status epilepticus by kainic acid.Methods 45 ICR male mice were selected and randomly divided into the control group，the SE group and the Emodin group，15 cases in each group.The epileptic model of mice was established by kainic acid.The treatment group was injected with 200 mg/kg by Emodin.The SE group and the control group were injected an equal amount of saline.HE stain was observed the morphological changes in hippocampal nerve after 24 h，RT-PCR and Western blot was used to detect the expression of the mRNA and protein level of iNOS，COX-2.Results Emodin could significantly relieve the hippocampal injury after status epilepticus in mice.The content of iNOS，COX-2 mRNA and protein in the Emodin group was significantly lower than that of the mRNA and protein in the SE group，with significant difference （P<0.05）.Conclusion Emodin may derease the expressions of the mRNA and protein 1evel of iNOS，COX-2 in hippocampus after status epilepticus in mice.

[Key words]Emodin；Epilepsy；iNOS；COX-2

癲癇是神經科的常見疾病之一，發作形式多樣，具有很高的發病率和致殘率。癲癇發作可激活神經元、神經膠質細胞等釋放大量氧自由基和炎癥因子，從而造成腦組織的再次損傷[1]。iNOS和COX-2是神經炎癥的重要介質，在缺血、缺氧等損傷因素的作用下，參與腦組織早期炎癥反應，并對神經興奮性的增高起到重要作用[2-3]。本實驗采用海人酸建立癲癇模型，探討大黃素對小鼠癲癇發作后海馬組織中iNOS、COX-2表達的影響。

1材料與方法

1.1材料

海人酸（批號：K0250）與大黃素（批號：E7881）均購自美國Sigma公司；兔抗鼠iNOS、COX-2多克隆抗體購自Santa Cruz公司；RT-PCR試劑盒來源于Promega公司；蛋白濃度試劑盒由碧云天生物技術研究所提供；ICR健康雄性小鼠45只[許可證號：SCXK（滬）2007-0005]，體重為23～28 g，購自上海斯萊克實驗動物中心，飼養條件：常溫，濕度（55±）5%，亮暗周期為12/12 h，自由飲水和進食標準飼料。

1.2動物模型建立及給藥

將45只ICR小鼠按照隨機數字表法分為癲癇持續狀態（SE）組、大黃素治療組、對照組，每組15只。采用海人酸（腹腔內注入、12 mg/kg）建立SE模型。按Racines[4]分級標準評價癲癇行為，具體如下。0級：正常行為；Ⅰ級：面部肌肉痙攣表現為咀嚼運動、眨眼、動須等，濕狗樣顫動；Ⅱ級：頸部肌肉痙攣表現為點頭運動；Ⅲ級：一側前肢陣攣；Ⅳ級：站立伴雙前肢陣攣；Ⅴ級：在Ⅳ級的基礎上身體向后倒下失去平衡，四肢抽動。達到Ⅲ級改變以上者定為癲癇發作，連續的癇性發作>30 min者為癲癇持續狀態。模型制備成功后，大黃素治療組立即腹腔注射大黃素200 mg/kg 1次。對照組、SE組在相同時間給予相應體積的生理鹽水。

1.3標本制備

每組取5只ICR小鼠，麻醉后心臟灌注40%甲醛后取腦，浸泡24 h。通過石蠟包埋切片，用于HE染色；每組另取10只ICR小鼠，麻醉后斷頭取雙側海馬，分別提取總蛋白與RNA，用于Western blot與RT-PCR的檢測。endprint

1.4 HE染色

石蠟切片4 μm，常規脫蠟脫水行HE染色，觀察海馬CA1、CA3區神經細胞的形態學變化。

1.5 RT-PCR檢測iNOS和COX-2的mRNA表達

β-actin引物序列（198bp）：5′-ATC GTG CGT GAC ATC AAA GAGA-3′（上游），5′-TGC CAC AGG ATT CCA TAC CCAA-3′（下游）。iNOS引物序列（314bp）：5′-CTG CAG CAC TTG GAT CAG GAA CCTG-3′（上游），5′-GGG AGT AGC CTG TGT GCA CCT GGAA-3′（下游）。COX-2引物序列（374bp）：5′-CCA TGT CAA AAC CGT GGT GAATG-3′（上游），5′-ATG GGA GTT GGG CAG TCA TCAG-3′（下游）。用Trizol提取總RNA，反轉錄得到cDNA。熱循環條件：94℃預變性4 min，94℃變性40 s，退火（iNOS：56℃ 40 s；COX-2：64℃ 40 s），72℃延伸1 min，32個循環。凝膠掃描分析儀掃描凝膠，并分析iNOS、COX-2與β-actin基因譜帶的積分光密度，以兩者比值（即相對系數）表示mRNA相對表達水平。

1.6 Western blot檢測iNOS和COX-2蛋白表達

勻漿后提取總蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。取蛋白40 μg凝膠上電泳。將蛋白轉移至NC膜上，TTBS洗3次，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h。封閉后分別加入iNOS和COX-2一抗抗體，4℃靜置過夜，洗膜3次，室溫下HRP標記二抗孵育1 h，洗膜3次。ECL顯影劑顯影，以激光掃描儀進行定量掃描。

1.7統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差和Bonferroni檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1行為學觀察

各組進行藥物干預后，SE組持續出現頭面部肌肉抽搐、點頭運動、凝視、雙前肢強直，雙前肢離地后肢站立，尾巴強直、轉圈、尖叫、四肢及全身強直，最后跌倒無法爬起，反射消失等。4 h后癥狀逐漸減輕，6～24 h仍有部分小鼠出現癲癇發作。發作級別多為Ⅳ～Ⅴ級，且發作次數頻繁。大黃素治療組發作級別多為Ⅲ級以下，且發作頻率減少。對照組未出現癲癇發作。

2.2 HE染色

對照組海馬CA1、CA3區細胞排列整齊，形態與結構正常，著色均勻。SE組細胞結構異常，排列紊亂，核固縮深染、核仁消失、細胞排列稀疏，有的神經元腫脹，呈梭形或三角形，細胞與周圍分界不清。大黃素治療組可見少量神經元腫脹、核固縮深染等現象，較SE組有顯著改善（圖1）。

2.3 iNOS和COX-2 mRNA的表達

對各組條帶進行光密度分析，對照組僅有少量的iNOS和COX-2 mRNA表達；而SE組iNOS和COX-2 mRNA表達明顯增多（P<0.01）。與SE組相比，大黃素治療后可降低iNOS和COX-2 mRNA的表達，差異有統計學意義（P<0.05）（圖2、表1）。

2.4 iNOS和COX-2蛋白的表達

對照組中iNOS、COX-2蛋白的表達量均較少，SE組中iNOS和COX-2蛋白的表達量顯著增加，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01）。與SE組相比，大黃素治療組可顯著降低iNOS和COX-2蛋白的表達量（P<0.05）（圖3、表2）。

3討論

炎癥反應是癲癇的重要損傷機制之一，癲癇發作后可激活大量氧自由基和炎癥介質的釋放。炎性反應可增加神經元興奮性、誘導神經細胞壞死與凋亡[5-6]。在高炎癥因子和高興奮性的病理情況下，神經生長因子可引起軸突出芽、異常突觸形成、苔蘚纖維出芽及海馬硬化，最終導致或加重癲癇形成惡性循環[7]。iNOS和COX-2是神經炎癥的重要介質，對癲癇發作后的炎性損傷及腦水腫的發生、發展起重要作用，抑制兩者的合成，可以通過阻斷NO的神經毒性、減輕血-腦脊液屏障的破壞及腦血管內皮的損傷而明顯減輕腦組織的炎性損傷[8]。研究顯示，癲癇發作后動物海馬區域迅速蓄積大量COX-2。COX-2在癲癇中的作用主要通過降低癲癇發作的閾值，參與癲癇發作的炎癥反應，并可通過P糖蛋白調控血-腦脊液屏障對藥物的作用[9]。還有文獻報道，大鼠在敲除COX-2基因后或應用COX-2選擇性抑制劑后，都可減少癲癇發作后炎癥因子的釋放[10]。本研究結果顯示，癲癇發作后COX-2的表達量明顯增多，與文獻報道一致。

一氧化合酶（NOS）有三種類型，包括神經元型（nNOS）、內皮型（eNOS）及誘導型（iNOS），前兩種主要分布于血管內皮細胞、神經細胞、血管平滑肌細胞和血小板，iNOS主要分布于星形膠質細胞和小膠質細胞、血管平滑肌細胞及血管內皮細胞[11]。iNOS可在內毒素、脂多糖等外界因素的刺激下被激活，活化后的iNOS可生成大量的NO，而高濃度的NO對細胞有毒性作用[12]。研究顯示，小鼠癲癇發作后iNOS mRNA的表達量顯著增多，經藥物干預后，iNOS含量明顯減少，從而減少癲癇持續狀態后對腦組織的損傷[13]。

大黃素是中藥大黃的主要有效單體，具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制、抗病毒、改善微循環等作用[14-16]。最近文獻報道，大黃素可減輕大鼠癲癇發作后的腦水腫，升高SOD、Na+-K+-ATP酶活性，降低MAD水平，具有腦保護作用[17]。Yang等[18]用海人酸建立大鼠顳葉癲癇模型，經腹腔注入大黃素后，大鼠癲癇發作級別降低，腦電圖提示棘波、尖波等癲癇波發放減少。本研究基于上述研究基礎，采用海人酸誘導小鼠癲癇持續狀態模型，制模成功后，用大黃素進行干預治療，結果顯示，癲癇發作后小鼠海馬內iNOS和COX-2 mRNA及蛋白的含量明顯增加，與文獻報道一致。大黃素治療后能顯著減少海馬組織中iNOS、COX-2的表達，從而減少癲癇持續狀態后對腦組織的再次損傷，具有腦保護作用。其具體作用機制有待進一步研究。endprint

[參考文獻]

[1]Vezzani A，Fujinami RS，White HS，et al.Infections，inflammation and epilepsy[J].Acta Neuropathol，2016，131（2）：211-234.

[2]Serrano GE，Lelutiu N，Rojas A，et al.Ablation of cyclooxygenase-2 in forebain neurons is neurprotective and dampens brain inflammantion after epilepticus[J].J Neurosci，2011，31（42）：14850-14860.

[3]Bahar T，Belma K，Ayse N，et al.Contribution of iNOS/sGC/PKG pathway，COX-2，CYP4A1，and gp91phox to the protective effect of 5，14-HEDGE，a 20-HETE mimetic，against vasodilation，hypotension，tachycardia，and inflammation in a rat model of septic shock[J].Nitric Oxide，2013，33（9）：18-41.

[4]Racine RJ，Steingart M，Mcintyre DC.Development of kindling-prone and kindling resistant rats：selective breeding and electrophysiological studies[J].Epilepsy Res，1999，35（3）：183-195.

[5]Annamaria V，Jacqueline F，Tamas B，et al.The role of inflammation in epilepsy[J].Nat Rev Neurol，2011，7（1）：31-40.

[6]Raimondo D，Clifford LE，Cinzia F，et al.Novel frontiers in epilepsy treatments：preventing epileptogenesis by targeting inflammation[J].Expert Rev Neurother，2013，13（6）：615-625.

[7]Maria T.Hippocampal sclerosis in epilepsy：a neuropathology review[J].Neuropathol Appl Neurobiol，2014，40（5）：520-543.

[8]Cheng O，Ostrowski RP，Wu B，et al.Cyclooxygenase-2 mediates hyperbaric oxygen preconditioning in the rat model of transient global cerebral ischemia[J].Stroke，2011，2（2）：484-490.

[9]Rojas A，Jiang J，Ganesh T，et al.Cyclooxygenase-2 in epilepsy epilepsia[J].2014，55（1）：17-25.

[10]Jiang J，Quan Y，Ganesh T，et al.Inhibition of the protaglanin receptor EP2 following status epilepticus redcues delayed mortlity and brain inflammation[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（9）：3591-3596.

[11]Harumasa N，Kyungho C，Shohei S，et al.iNOS as a driver of inflammation and apoptosis in mouse skeletal muscle after burn injury：possible involvement of sirt1 S-nitrosylation-mediated acetylation of p65 NF-κB and p53[J].PLoS One，2017，12（1）：e0170391.

[12]Iadecola C，Zhang F，Casey R，et al.Inducible nitric oxide synthase gene expression in vascular cells after transient focal cerebral ischemia[J].Stroke，1996，27（8）：1373-1380.

[13]歐陽龍強，梁日生，楊衛忠，等.黃芩苷對小鼠癲癇持續狀態后海馬神經細胞的保護作用[J].中華實驗外科雜志，2012，29（9）：1697-1699.

[14]Park SY，Jin ML，Ko MJ，et al.Anti-neuroinflammatory effect of emodin in LPS-stimulated microglia：involvement of AMPK/Nrf2 activation[J].Neurochm Res，2016，41（11）：2981-2992.

[15]He Y， Huang J，Wang P，et al.Emodin potentiates the antiproliferative effect of interferon α/β by activation of JAK/STAT pathway signaling through inhibition of the 26S proteasome[J].Oncotarget，2016，7（4）：4664-4679.

[16]Yang F，Yuan PW，Hao YQ，et al.Emodin enhances osteogenesis and inhibits adipogenesis[J].BMC Complement Altern Med，2014，14：74.

[17]顧建文，鄭崇勛，楊文濤，等.大黃素對大鼠癲癰模型的腦保護作用[J].中華神經醫學雜志，2006，5（7）：676-680.

[18]Yang T，Kong B，kuang Y，et al.Emodin plays an interventional role in epileptic rats via multi-drug resistance gene 1 （MDR1）[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（3）：3418-3425.

（收稿日期：2017-08-10 本文編輯：祁海文）endprint