GPⅢa PLA2、PEAR1、PTGS1基因多態性與阿司匹林臨床抗血栓療效關聯性研究

石秀錦，胡志旭，彭文星，李 驍，徐曉宇，續茜橋，林 陽（.首都醫科大學附屬北京安貞醫院藥事部，北京

100029；2.首都醫科大學化學生物學與藥學院臨床藥學系，北京 100069；3.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院藥劑科，北京 100038）

阿司匹林和氯吡格雷雙抗治療成為介入術后預防血栓、腦中風等缺血性心血管事件的常規方案。阿司匹林抗血小板作用機制為直接并不可逆地抑制環氧化酶1和2（COX-1和COX-2），減少前列腺素的合成，抑制血小板合成血栓素A2（TXA2），從而抑制血小板聚集。同時，阿司匹林也可抑制低濃度膠原、凝血酶、抗原-抗體復合物等所致的血小板聚集和釋放反應及自發性聚集，由此發揮預防血栓的作用。但阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）現象十分常見，發生率在5.5%～60%之間[1]。研究[2]表明，有AR的患者發生急性冠脈綜合征和心血管缺血事件的風險會增加。AR的確切機制還不明確，但研究發現基因多態性與AR有一定關系，目前研究的基因多態性包括：血小板糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa基因多態性、環氧合酶（COX-1）基因的多態性、血小板糖蛋白Ⅰa/Ⅱa受體基因多態性、ADP受體P2Y1基因的變化等[3-6]。若這些位點突變為失功能等位基因可使阿司匹林的療效降低，并增加患者心血管事件的發生率[7]。本研究分析GPⅢa PLA2、PEAR1、PTGS1三個基因位點的突變情況及其與阿司匹林臨床療效的相關性，進一步探討影響阿司匹林療效的遺傳因素，為臨床制定合理的抗血小板方案提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究人群

回顧性收集2015年1月–2016年5月入院并進行阿司匹林基因檢測的747例患者信息資料，最終篩選出138例患者。納入標準：服用標準劑量的阿司匹林100 mg·d-1和氯吡格雷75 mg·d-1抗血小板治療，持續至少3 d，用藥3 d后進行血小板聚集率檢測，已完成GPⅢa PLA2、PTGS1、PEAR1的基因檢測。排除標準：慢性肝病病史，嚴重腎功能不全（Cr ＜ 30 mL·min-1），合并出血性疾病，有阿司匹林或氯吡格雷的禁忌癥，只使用單抗治療，血小板計數小于100×109·L-1，合并使用華法林，同時使用其他非類固醇類抗炎藥物。

1.2 血小板聚集率

枸櫞酸抗凝管采血3～5 mL，比濁法進行血小板功能檢測，先將試管在4000～5000 r·min-1離心5 min，得到富含血小板的血漿（PRP），再于22 500 r·min-1高速離心15 min獲得含少量血小板的血漿（PPP），將PPP加入PRP中，將血小板濃度稀釋至2×105·μL-1，加入6 μmol·L-1的花生四烯酸誘導血小板聚集，之后采用儀器Chrono-Log Lumi-aggregometer（model 700，美國Chrono-Log公司）測定血小板聚集率。

1.3 基因位點測定

用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采血2～3 mL，采用熒光染色原位雜交檢測法。取150 μL血加入1 mL紅細胞裂解液，靜置5 min后，在3000 r·min-1離心5 min，棄上清，再加入核酸純化試劑（北京華夏時代基因科技發展有限公司），混勻后加入相應的測序反應通用試劑（北京華夏時代基因科技發展有限公司），采用雙通道實時熒光定量PCR儀（TL988A，西安天隆科技有限公司）進行檢測。

1.4 分組定義

本次研究中，由于樣本特性，以PEAR1基因型進行實驗分組，分為野生組和突變組。野生組定義為GPⅢa PLA2、PTGS1基因型為TT、AA，PEAR1基因型為GG；而突變組定義為GPⅢa PLA2、PTGS1基因型為TT、AA，PEAR1基因型為AG或AA。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0對數據進行統計學分析。正態性連續性變量采用（均值±標準差）表示，非正態性資料采用中位數和四分位數表示，計數資料采用百分比表示。正態性連續性變量采用雙側t檢驗比較兩組之間的差異，計量資料采用卡方檢驗或者Fisher精確檢驗?；蛐偷谋容^采用單因素ANOVA分析，兩組之間基因型或者位點的比較采用卡方檢驗，以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三個相關基因位點多態性

根據納入標準，統計納入的138例患者基因型，其中GPⅢa PLA2、PEAR1、PTGS1位點的野生基因型分別為TT、GG、AA。結果顯示GPⅢa PLA2基因在亞洲人群中突變頻率較低，突變率不足1%，C等位基因頻率為0.004，T為0.996。PTGS1基因突變頻率亦較低，突變率約為2%，G等位基因頻率為0.01，A為0.99。PEAR1基因突變率較高，為63.8%， A等位基因頻率為0.376，G為0.624，詳見表1。

表1 三個基因位點的突變情況Tab 1 Mutation of three geneloci

2.2 研究人群的基線水平

根據納入排除標準，最終納入138例目標患者，在進行數據處理中排除1例GPⅢa PLA2位點突變雜合型（該患者同時PTGS1位點為雜合型）和3例PTGS1位點突變雜合型，基于GPⅢa PLA2、PTGS1均為野生基因型，即基因型分別為TT、AA，依據PEAR1基因型分組，PEAR1基因為野生型（GG）組共49例（36.3%），突變組（AG和AA）共86例（63.7%）。135例患者的平均年齡為（62.05±11.24）歲。結果顯示兩組人群一般情況均無顯著性差異，表明患者的年齡、性別、BMI、合并癥（高血壓、糖尿病、高脂血癥）和合并用藥（他汀類、ACEI、ARB、β受體阻滯劑、質子泵抑制劑、肝素類、前列地爾類）等均不是引起阿司匹林療效差異的危險因素，詳見表2。

表2 研究人群的基線信息Tab 2 Baseline characteristics of the study population

2.3 PEAR1基因多態性與血小板聚集率的關聯性

不同基因型的PEAR1基因位點花生四烯酸誘導的血小板聚集率的差異見表3。結果顯示，PEAR1突變純合型的血小板聚集率顯著高于野生型（P=0.007），而突變雜合型與野生型相比未表現出顯著性差異（P=0.135）。PEAR1基因突變型（AG和AA）的血小板聚集率顯著高于野生型GG（P=0.040），從總體來看，突變位點數目越多，對應的血小板聚集率就越高。

3 討論

3.1 結果討論與相關研究

阿司匹林抵抗及其臨床療效問題是由多種因素造成的，目前已知的因素有基因多態性（GPⅢa PLA2、PEAR1、PTGS1等）、患者的依從性、生活習慣方式（有無吸煙、酗酒等）以及多種藥物同時服用的相互作用等，而基因多態性是其中非常重要且研究較多的危險因素。本研究擬對GPⅢa PLA2、PTGS1及PEAR1基因與阿司匹林抗血栓療效的關聯性進行研究。

表3 PEAR1基因多態性與血小板聚集率的關聯性Tab 3 The correlation between PEAR1 gene polymorphisms and platelet aggregation rate

Verschuren等[8]納入1327例ST段抬高型心肌梗死患者的隊列研究發現，PTGS1基因位點的突變顯著增加了阿司匹林抵抗的風險（P=0.001），故建議對心血管事件復發風險高的ST段抬高型心肌梗死患者進行基因型檢測。Lep?ntalo等[9]以血小板聚集率為標準定義阿司匹林抵抗，發現60%的阿司匹林抵抗患者均攜帶突變位點G，而無阿司匹林抵抗患者只有17%攜帶突變基因（OR=7.3，P=0.017）。Dropinski等[10]的研究表明，GPⅢa基因PLA1/A2多態性位點中野生型PLA1在使用阿司匹林后血栓形成被抑制和出血時間延長比突變型PLA2明顯。Goodman等[11]綜合多項研究結果認為，PLA1/A2 多態性位點是影響阿司匹林療效的一個重要因素，與阿司匹林抵抗的發生相關。但本研究由于PTGS1及GPⅢa PLA2基因位點多態性罕見，無法進行關聯性分析，PTGS1和GPⅢa PLA2基因與阿司匹林抗血栓療效的相關性還有待于大樣本的進一步研究。

既往研究[12]顯示中國人群中PEAR1的野生G基因的基因頻率為0.61，突變A基因的頻率為0.39，與本研究PEAR1突變頻率非常一致。本研究根據PEAR1基因有無突變情況分為野生組和突變組，兩組患者的基線水平沒有顯著性差異，結果顯示PEAR1基因的突變型顯著增加了阿司匹林抵抗的風險，純合突變基因型尤為顯著（P=0.007）。Lewis等[13]對1000例患者的研究發現，PEAR1基因與患者對抗血小板治療的反應具有強烈的相關性（P=7.66×10-9）。高加索人與美國黑人攜帶突變基因患者PCI術后比攜帶野生型基因患者有更高的心血管事件發生率和死亡率[風險比（HR）=2.62，P=0.059；HR=3.97，P=0.035]。在服用阿司匹林和氯吡格雷雙抗治療的患者中，攜帶突變基因患者比野生型基因患者心肌梗死的發生率更高[比值比（OR）=2.03，P=0.048]。Würtz等[6]在一項985例穩定性冠心病患者服用阿司匹林單藥治療的研究中發現，PEAR1基因突變與血小板高活性具有相關性，突變基因型AA或AG的患者使用阿司匹林（或聯合氯吡格雷）時的心肌梗死發生率和死亡率會增高。本研究也得出了阿司匹林抵抗與PEAR1基因型密切相關的結論，但本研究PEAR1突變雜合型者較野生型者的血小板聚集率增加程度尚不具有顯著性差異（P=0.135），原因可能是本研究樣本量小，也可能是突變雜合型并未使血小板內皮聚合受體有大量表達，因而血小板聚集率并未顯著提高，但仍需大樣本研究加以驗證。

另外，有研究統計臨床資料發現，年齡大、有糖尿病史、HDL水平低的患者阿司匹林抵抗發生率高，而本研究對于糖尿病、高血脂等危險因素并未得出陽性結論，可能與本次研究樣本量偏小有關，因而需要更大樣本量、嚴謹的實驗加以驗證。

3.2 實驗方法

本研究采用比濁法進行血小板功能檢測，與先前的研究采用了相似的檢測方法[14]。血小板聚集試驗是一種體外的血小板功能檢測，雖然該方法有一定的局限性，如重復性較差和繁瑣的制作樣本流程，但仍是最常用的血小板功能檢測的方法之一。有研究顯示，根據血小板功能檢測調整給藥方案不能改善患者的預后，但這些研究主要研究人群并不是有缺血性疾病患者，同時這些患者本身發生心血管不良事件風險就比較低。

3.3 局限性

本研究并未獲得患者的預后信息，僅根據血小板聚集率指標反映藥物療效，未獲得藥物的臨床反應性。其次，采用比濁法進行血小板功能檢測，不能獲得良好的重現性，導致結果可能有所偏差。本研究為回顧性分析，每個患者進行血小板功能檢測的時間不完全相同，可能造成實驗室檢測結果的差異。此外，由于本研究樣本量小，且GPⅢa PLA2和PTGS1位點的突變率低，因而本研究無法分析GPⅢa PLA2、PTGS1基因位點與阿司匹林臨床療效的關聯性情況，需大樣本研究加以分析比較。

4 小結

本研究揭示了基因檢測是預測患者對血小板反應性的方法之一，在患者進行治療之前進行基因型檢測，可根據患者的基因型選擇合適的治療方案，避免因藥物未起效而發生急性缺血性事件。且基因檢測較其他檢測方法更方便快捷，能及時為臨床提供準確的藥物基因信息，并可初步預測患者的阿司匹林抵抗風險，為患者選擇合適的抗血小板藥物提供參考依據。

[1] 彭文星，馮頻頻，石秀錦，等.阿司匹林抵抗的基因多態性及個體化治療[J].中國藥房，2016，27（23）：3172-3174.

[2] Pamukcu B, O fl az H, Oncul A,et al. The role of aspirin resistance on outcome in patients with acute coronary syndrome and the effect of clopidogrel therapy in the prevention of major cardiovascular events[J]. J Thromb Thrombolysis, 2006, 22(2):103-110.

[3] 韓雅玲.冠心病阿司匹林抵抗的研究與對策[J].中國實用內科雜志，2015，35（1）：3-7.

[4] Li Y, Chen F, Zhang X,et al. Angiotensin type 1 receptor A1166C gene polymorphism is associated with endothelial dysfunction and in-stent restenosis after percutaneous coronary intervention[J].Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(6): 7350-7357.

[5] Yao Y, Tang XF, Zhang JH,et al. Association of PEAR1 genetic variants with platelet reactivity in response to dual antiplatelet therapy with aspirin and clopidogrel in the Chinese patient population after percutaneous coronary intervention.[J]. Thromb Res, 2016, 141: 28-34.

[6] Würtz M, Nissen PH, Grove EL,et al. Genetic determinants of on-aspirin platelet reactivity: focus on the in fl uence of PEAR1[J].PLoS One, 2014, 9(10): e111816.

[7] Oh MS, Yu KH, Lee JH,et al. Aspirin resistance is associated with increased stroke severity and infarct volume[J]. Neurology,2016, 86(19): 1808-1817.

[8] Verschuren JJ, Boden H, Wessels JA,et al. Value of platelet pharmacogenetics in common clinical practice of patients with ST-segment elevation myocardial infarction[J]. Int J Cardiol,2013, 167(6): 2882-2888.

[9] Lep?ntalo A, Mikkelsson J, Reséndiz JC,et al. Polymorphisms of COX-1 and GPVI associate with the antiplatelet effect of aspirin in coronary artery disease patients[J]. Thromb Haemost, 2006,95(2): 253-259.

[10] Dropinski J, Musial J, Sanak M,et al. Antithrombotic effects of aspirin based on PLA1/A2 glycoproteinⅢa polymorphism in patients with coronary artery disease[J]. Thromb Res, 2007,119(3): 301-303.

[11] Goodman T, Ferro A, Sharma P. Pharmacogenetics of aspirin resistance: a comprehensive systematic review[J]. Br J Clin Pharmacol, 2008, 66(2): 222-232.

[12] Allele Frequencies. rs12041331 at chr1：156869714（hg38）in PEAR1[EB/OL]. （2015-05-04）[2017-09-01]. https://www.pharmgkb.org/rsid/rs12041331.

[13] Lewis JP, Ryan K, O'Connell JR,et al. Genetic variation in PEAR1 is associated with platelet aggregation and cardiovascular outcomes[J]. Circ Cardiovasc Genet, 2013, 6(2): 184-192.

[14] 彭文星，徐曉宇，石秀錦，等.PCI術后患者CYP2C19基因多態性與氯吡格雷抵抗關聯性研究[J].中國藥物應用與監測，2015，12（6）：334-338.