HPLC-HG-AFS法測定亞砷酸治療的急性早幼粒細胞白血病患者尿液中砷代謝產(chǎn)物

王文靜，胡 爽，郭美華，高春璐，海 鑫（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，黑龍江 哈爾濱 150001）

急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓細胞白血病（AML）的一種特殊類型[1]。亞砷酸在治療APL上已經(jīng)取得了良好的療效，大大提高了APL的緩解率，減少了復(fù)發(fā)。但與此同時，我們也不能忽視砷在體內(nèi)蓄積所帶來的不良反應(yīng)，亞砷酸吸收進入人體內(nèi)后迅速氧化甲基化產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，各種不同砷代謝物在體內(nèi)的分布濃度與其治療的有效性和毒性有密切聯(lián)系[2]。

因此，選擇適當?shù)纳飿颖炯胺椒z測砷代謝產(chǎn)物，分析其在形式、分布及變化規(guī)律，并根據(jù)檢測結(jié)果做出毒性預(yù)警顯得尤為必要。目前檢測砷代謝產(chǎn)物最常應(yīng)用的檢測儀器為高效液相色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-ICP-MS）[3-6]。ICP-MS具有高靈敏度、選擇性好、可多元素同時測定等優(yōu)點，但是儀器價格和運行費用都很昂貴，并且在測定過程中生成的氯化氬相對分子質(zhì)量與砷接近，對砷代謝物測定產(chǎn)生干擾，加入試劑減少干擾又將使測定增加難度，限制了它在實際檢測工作中的使用。與HPLCICP-MS相比，HPLC-HG-AFS的靈敏度相當，砷燈的使用使其專屬性高，干擾少，且儀器價格及運行費用低，僅為ICP-MS的1/10，測量結(jié)果準確高效，操作方法簡單，便于推廣，適合運用于實際臨床檢測工作中砷含量的測量。

人體攝入的砷，大部分以代謝和未代謝的形式通過尿液排出體外[7]，檢測尿液砷中砷形態(tài)可評估該患者的砷代謝排泄能力，以及評估毒性蓄積情況。與血液樣本相比，尿液樣本采集簡單方便，且尿液的基質(zhì)簡單，分析前只需稀釋過濾，減少了前處理所造成的各種砷代謝產(chǎn)物含量損失。本實驗擬建立一個應(yīng)用HPLC-HG-AFS法測定應(yīng)用亞砷酸治療的APL患者尿液中砷代謝產(chǎn)物濃度的方法，旨為臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HPLC-HG-AFS（LC-AFS 6500，北京海光儀器有限公司），超聲波清洗儀（CPX 5800 H-C，美國必能信公司），超純水儀（GENPUREPRO，Thermofisher科技有限公司），真空泵（AP-9950，天津奧特賽恩斯儀器有限公司），多功能高速離心機（5430，德國Eppendorf公司），離心機（AllegraX-22R，美國Beckman Coulter公司），電子天平（TE601-L，德國Sartorius公司）。

1.2 試劑

質(zhì)量濃度（以砷計）分別為75.7、17.5、25.1、52.9 μg·g-1的亞砷酸根（AsⅢ）、砷酸根（AsV）、一甲基砷酸（MMA）和二甲基砷酸（DMA）溶液標準物質(zhì)（中國計量科學(xué)研究院）；無水磷酸二氫鈉（99.00%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；無水乙酸鈉（99.00%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；硝酸鉀（99.00%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（99.00%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；硼氫化鉀（98.00%，天津化學(xué)試劑研究所）；氫氧化鉀（82.60%，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；鹽酸（優(yōu)級純，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心）；高純氬氣（100.00%，哈爾濱黎明氣體有限公司）；超純水（Thermo fi sher純水儀自制）。

1.3 臨床樣本的收集

采集7例臨床正在接受亞砷酸治療的APL患者第7、14、21、28天晨尿，分裝，于– 80 ℃保存。

2 方法

2.1 色譜及原子熒光條件

色譜條件：陰離子交換色譜柱：Hamilton PRP-X 100柱（4.1 mm×250 mm，10 μm）；流動相：CH3COONa（13 mmol·L-1）-NaH2PO4（3 mmol·L-1）-KNO3（4 mmol·L-1）-EDTA·2Na（0.2 mmol·L-1），pH =6；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：100 μL。

原子熒光條件：還原液：3% KBH4（m/v）-0.5%KOH（m/v）；載流液：10% HCl溶液（v/v）；主電流：80 mA，輔電流：40 mA；屏蔽氣流量：900 mL·min-1；載氣流量：300 mL·min-1；負高壓：300 V；泵轉(zhuǎn)速：65 r·min-1。

2.2 溶液的配制

儲備液配制：用移液器分別精密量取適量AsⅢ標準溶液、AsV標準溶液、DMA標準溶液，MMA標準溶液于10 mL棕色容量瓶中，用超純水定量至刻度，分別配成濃度為1000、500、800、500 ng·mL-1的母液，轉(zhuǎn)移到20 mL棕色試樣瓶中，置于4 ℃冰箱中避光保存。臨用前用流動相稀釋得到系列標準工作液。

2.3 尿液樣本的處理

將冷凍保存的尿液樣本在室溫下融化后，用移液器量取尿液60 μL，置于1.5 mL EP管中，加入流動相1140 μL，渦旋30 s混勻后，13 000 r·min-1，4 ℃，離心10 min，過濾取上清液備用。根據(jù)預(yù)測定的結(jié)果再取適量上清液加入適量流動相稀釋，混勻后取100 μL進樣檢測分析。

3 結(jié)果

3.1 線性范圍及檢測限

取AsⅢ、DMA、MMA、AsV標準儲備液，分別用流動相稀釋成質(zhì)量濃度在2.0～100.0 ng·mL-1（2.0 ng·mL-1，4.0 ng·mL-1，8.0 ng·mL-1，10.0 ng·mL-1，20.0 ng·mL-1，40.0 ng·mL-1，100.0 ng·mL-1）范圍的系列標準工作液。取100 μL進樣檢測分析，以各形態(tài)砷的峰面積（Y）對已知濃度（X）進行回歸分析，分別繪圖得到標準曲線，直線回歸得到相關(guān)系數(shù)和回歸方程。結(jié)果表明在2.0～100.0 ng·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。見表1。

表1 砷代謝產(chǎn)物的回歸方程及線性范圍Tab 1 Regression equation and linear range of arsenic metabolites

3.2 精密度實驗

日內(nèi)精密度的測定：分別配制8.0、40.0、100.0 ng·mL-1的低、中、高濃度質(zhì)控液各5例，按“2.3”項處理并在同一天測定，計算均值（mean），標準差（SD）及相對標準差RSD（CV/%）[RSD（CV%）=SD/mean×100%]。日間精密度的測定：依照上述方法測定處理，連續(xù)測定3 d，同法計算。結(jié)果顯示，日內(nèi)RSD ≤ 1.78%，日間RSD ≤ 1.97%。詳見表2。

表2 尿樣中砷各種代謝物日間精密度和日內(nèi)精密度分析Tab 2 Intra-day precision and inter-day precision analysis

3.3 準確度實驗

取1例患者尿樣，分成4組，每組3份。第一組按“2.3”項處理并測定。第二、三、四組取尿樣60 μL，加入流動相540 μL，分別向每份尿樣中各加入四種砷形態(tài)標準溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為8.0、40.0、100.0 ng·mL-1的低、中、高質(zhì)控液，渦旋混勻30 s，13 000 r·min-1，4 ℃，離心10 min，取上清液過濾，取100 μL進樣測定，計算加標回收率。檢測結(jié)果表明四種砷形態(tài)（AsⅢ，DMA，MMA，AsV）的加標回收率均在82.19%～109.18%之間（n=5）。詳見表3。

表3 加標回收率分析Tab 3 Analysis of spike recovery

3.4 穩(wěn)定性實驗

室溫穩(wěn)定性：將3例患者樣本室溫下放置6 h后按“2.3”項處理并測定，進樣分析，每組5份。凍融穩(wěn)定性：將3例患者樣本于– 80 ℃冰箱內(nèi)冷凍24 h后，取出樣品，融化完全，再放入冰箱冷凍，反復(fù)凍融3次（3 d）后按“2.3”項處理并測定，每組5份。長期穩(wěn)定性：將3例患者樣本于– 80 ℃冰箱內(nèi)冷凍40 d后，取出樣品，按“2.3”項處理并測定，每組5份。以第一天立刻測定的值為參考值，計算存放不同時間的樣品下降率（偏差值）。由表可知，四種砷形態(tài)偏差值均在– 1.62%～2.01%之間，在±15%范圍內(nèi)，穩(wěn)定性良好。詳見表4。

3.5 臨床患者樣本測定

另選7例患者尿樣，其中2例（1～2）為“慢點法”（0.16 mg·kg-1·d-1，每天持續(xù)靜注18～20 h）治療，5例為（3～7）“常規(guī)法”（0.16 mg·kg-1·d-1，每天靜注2 ～3 h）治療[8-9]。研究表明，每天連續(xù)攝入等劑量的砷（125～1000 μL），5 d內(nèi)尿液中砷的濃度將達到平衡[10]，因此，分別搜集亞砷酸治療5 d以后的APL患者晨尿樣本，按“2.3”項下所述方法進行處理，進樣分析，用已建立標準曲線計算尿樣中砷四種代謝產(chǎn)物的濃度。圖1為四種形態(tài)砷工作液色譜圖，“常規(guī)法”治療的APL患者晨尿色譜圖，“慢點法”治療的APL患者晨尿色譜圖。采用“慢點法”治療的患者甲基化程度明顯大于“常規(guī)法”治療的患者，且砷排泄量增加，預(yù)防體內(nèi)蓄積。表5為晨尿中砷代謝產(chǎn)物濃度匯總統(tǒng)計分析。

4 討論

4.1 流動相

目前檢測砷形態(tài)最常用的流動相為Na2HPO4·12H2O（5 mmol）-KH2PO4（25 mmol·L-1）[11]。在本實驗中使用文獻中推薦流動相Na2HPO4·12H2O（5 mmol）-KH2PO4（25 mmol·mL-1）時，AsⅢ和DMA的分離度差，并且AsV的峰展寬，峰形不理想。在此基礎(chǔ)上，我們對流動相進行多次調(diào)整，最后改用CH3COONa（13 mmol·mL-1）-NaH2PO4（3 mmol·mL-1）-KNO3（4 mmol·mL-1）-EDTA·2Na（0.2 mmol·mL-1）作為流動相，四種砷形態(tài)（AsⅢ、DMA、MMA、AsV）半峰寬小，峰形對稱，能在8 min內(nèi)分離，且分離度良好。

表4 尿液中砷代謝物穩(wěn)定性分析Tab 4 Analysis of stability of arsenic metabolites in morning urine

4.2 AFS條件

在實驗初期，我們對AFS條件，如還原液和載流液濃度以及主電流、輔電流等進行了探索，經(jīng)過大量實驗比較發(fā)現(xiàn)，當HCl和KBH4體積比分別為10%和3%時，基線平穩(wěn)，4種砷化學(xué)態(tài)的熒光強度均可達到最大。且在還原液KBH4中加入0.5% KOH可以提高KBH4的穩(wěn)定性，確保穩(wěn)定勻速的產(chǎn)生足夠的氫。主電流和輔電流在50 mA～25 mA和60 mA～30 mA的條件下，峰形變差，基線不夠平穩(wěn)，熒光強度低，當將主電流和輔電流調(diào)至80 mA～40 mA時，可得到理想的峰形，獲得更低檢測限（2 ng·mL-1）。

圖1 HPLC色譜圖A–標準溶液（4 ng·mL-1），B –常規(guī)法治療的APL患者晨尿， C–慢點法治療的APL患者尿樣；1–AsⅢ，2–DMA，3–MMA，4–AsVFig 1 HPLC chromatogramsA–standard solution (4 ng·mL-1), B–conventional treated APL patients' morning urine, C–continuously slow rate infused APL patients' morning urine; 1–AsⅢ, 2–DMA, 3–MMA, 4–AsV

表5 晨尿中砷代謝產(chǎn)物濃度統(tǒng)計Tab 5 Concentration statistics of morning urine in arsenic metabolites

4.3 臨床樣本分析

測量的7例患者樣本中，砷代謝產(chǎn)物比例存在明顯個體差異，但砷代謝的整體趨勢一致，AsV所占的比例最少，一般不超過2.5%，DMA和MMA所占的比例在54.7%～75%之間。我們用MMA/總砷和MMA/DMA來表示甲基化能力，通過實驗發(fā)現(xiàn)個體甲基化能力差異很大，如患者3尿液中MMA/DMA只有48.1%，而患者4尿液中MMA/DMA高達74%。臨床治療中發(fā)現(xiàn)，患者3出現(xiàn)了水腫、肝功能損傷等不良反應(yīng)，而患者4在治療中未發(fā)現(xiàn)砷相關(guān)的不良反應(yīng)。而甲基化能力的不同是否與患者的年齡、性別、病理狀態(tài)、治療階段（誘導(dǎo)與鞏固治療）、給藥方法、臨床療效、不良反應(yīng)等有關(guān)，需進一步研究確定。

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