兩種硫間苯二酚洗劑微生物限度檢查的方法建立及適用性研究

田懷平，林志燕，李 超，胡燕鋒（上海交通大學醫學院附屬新華醫院藥學部，上海 200092）

硫間苯二酚洗劑和小兒硫間苯二酚洗劑是我院應用多年的院內制劑，分別又稱痱子洗劑或小兒痱子洗劑。其處方與《中國醫院制劑規范》（西藥制劑第二版）收載的痱子洗劑略有不同[1]，主要成分有間苯二酚、升華硫和氧化鋅等。兩種洗劑的性狀均為微黃色或淡黃棕色混懸液。區別在于間苯二酚含量不同，后者一般用于兒童患者，具有殺菌、止癢、收斂等功效，用于無滲出的急性或亞急性皮炎等[2-3]。常規的質量控制包括鑒別、裝量、含量測定和微生物限度等。

《中國藥典》2015年版的微生物限度檢查在培養基、培養條件和檢驗方法等方面均有較大改變[2]。本文對兩種硫間苯二酚洗劑的微生物限度檢查法進行方法適用性驗證研究，為藥品質量控制部門提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ME204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；CLG-32L高壓蒸汽滅菌鍋（日本ALP CO.，Ltd.公司）；M017生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SW-CJ醫用型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；HTY-APL01集菌儀（杭州泰林生物技術設備有限公司）；集菌培養器（型號KSF330，批號20161105，杭州泰林生物技術設備有限公司）；PYX-DHS電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；MJ-250I霉菌培養箱（上海一恒科技有限公司）；Micro fl ex LT質譜儀（美國布魯克·道爾頓公司）。

1.2 樣品

硫間苯二酚洗劑和小兒硫間苯二酚洗劑來自本院制劑室生產的成品，規格分別是100 mL和60 mL，有效期限為1年。硫間苯二酚洗劑的抽樣批號為160425；小兒硫間苯二酚洗劑的抽樣批號分別為160419、160701和160808。

1.3 試驗菌種

金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003，批號5a29-1]、銅綠假單胞菌[Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B）10104，批號2a21-2]、枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis，CMCC（B）63501，批號2a22-2]、白色念珠菌[Candida albicans，CMCC（F）98001，批號2a15-3]和黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F）98003，批號OA1001]。試驗菌種均為中國食品藥品檢定研究院提供的0代菌種，試驗前傳代至第3代菌種使用。

1.4 培養基和稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂培養基（tryptic soy agar，TSA，批號20160107），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（sabouraud dextrose agar medium，SDA，批號20160126），胰酪大豆胨液體培養基（trypticase soytone broth，TSB，批號20160219），溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號20160125），甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號20160607）。稀釋液：0.9%無菌氯化鈉溶液（批號20160929）。配制好的培養基采用121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，高壓蒸汽滅菌采用3M1292生物指示劑（批號20160428，美國3M公司）驗證合格。培養基全部購自上海中科昆蟲生物技術開發有限公司。稀釋液為本院制劑室生產，質量檢查合格。各批次培養基與對照培養基的驗證試驗檢查合格[2]。

1.5 微生物限度標準[2]

硫間苯二酚洗劑和小兒硫間苯二酚洗劑為皮膚給藥制劑，微生物限度標準如下：需氧菌總數不超過102cfu·mL-1（1 mL或1 g可接受的最大菌數為200），霉菌和酵母菌總數不超過101cfu·mL（1 mL或1 g可接受的最大菌數為20），不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（1 mL）[2]。

2 方法

2.1 試驗菌液的制備

參照《中國藥典》2015年版方法，分別制備金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌液[2]。稀釋倍數在10-6～10-8之間，試驗組接種量為1 mL含菌50～100 cfu。菌液制備后，室溫放置2 h以內使用，若保存在2～8 ℃，24 h內使用。

2.2 供試液的制備

將洗劑混勻后，取10 mL加入0.9%無菌氯化鈉溶液至100 mL，稀釋成1 : 10的供試液。兩種洗劑分別制備供試液，制備后1 h內完成接種。

2.3 微生物計數檢查

2.3.1 需氧菌計數檢查及回收試驗 使用TSA培養基，菌種為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉。每種菌株分別進行如下四組操作。（1）加菌試驗組：1 : 10供試液100 mL，加入含50～100 cfu的試驗菌液1 mL，混勻后取10 mL過濾，濾膜孔徑≤0.45 μm，直徑50 mm，使用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL。（2）供試品對照組：同加菌試驗組操作，1 : 10供試液中不加菌。（3）菌液對照組：取0.9%無菌氯化鈉溶液100 mL替代1 : 10供試液，其余同加菌試驗組操作。（4）陰性對照組：取0.9%無菌氯化鈉溶液100 mL替代1 : 10供試液，不加菌液，其余同加菌試驗組操作。

轉移以上四組濾膜，菌面朝上貼于TSA培養基平板上，倒置培養。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌時，33 ℃培養不超過3 d；接種白色念珠菌和黑曲霉時，33 ℃培養不超過5 d。每株試驗菌制備2個平皿，取菌落數平均值作為計數培養結果，并進行供試品對照組和陰性對照組計數。加菌試驗組的菌落數減去供試品對照組的菌落數，二者的差值與菌液對照組菌落數進行比值，得到各試驗菌的回收比值。兩種制劑各進行3次獨立平行試驗。

2.3.2 霉菌和酵母菌計數檢查 使用SDA培養基，菌種為白色念珠菌和黑曲霉。每種菌株分別進行四組操作，分組和操作方法同“2.3.1”需氧菌計數檢查。轉移以上四組濾膜，菌面朝上貼于SDA培養基平板上，倒置培養，23 ℃培養不超過5 d。各試驗菌的回收比值計算方法同“2.3.1”。兩種制劑各進行3次獨立平行試驗。

2.4 微生物控制菌檢查

2.4.1 菌液驗證組 取1 : 10供試液10 mL，使用集菌培養器過濾，0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，最后一次沖洗液加入50～100 cfu的銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌的試驗菌，集菌培養器中注入TSB培養基100 mL，33 ℃培養18～24 h。銅綠假單胞菌檢查：加入對應試驗菌的培養物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，33 ℃培養18～72 h。金黃色葡萄球菌檢查：加入對應試驗菌的培養物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，33 ℃培養18～72 h。上述兩種培養基若有菌落生長，使用Microflex LT質譜儀進行分離純化鑒定，判斷是否檢出銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌。

2.4.2 供試品對照組和陰性對照組 取供試液10 mL不加菌，其余同“2.4.1”操作，為供試品對照組。用稀釋液0.9%氯化鈉滅菌溶液替代供試液，不加菌，其余同“2.4.1”操作，為陰性對照組。

若菌液驗證組能夠檢出銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，供試品對照組和陰性對照組均未檢出，可認為兩種硫間苯二酚洗劑的供試液制備及控制菌檢查方法適用性驗證合格。

3 結果

3.1 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的計數檢查的驗證結果

兩種硫間苯二酚洗劑分別進行了5個菌株兩種培養基，3次獨立平行試驗的驗證。所有菌種的回收比值均在0.5～2.0的范圍，認為1 : 10供試液制備、薄膜過濾處理和計數方法，進行需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數檢查時，兩種硫間苯二酚洗劑的適用性驗證都合格。結果見表1和表2。

表1 硫間苯二酚洗劑微生物計數檢查回收率比值Tab 1 Bacterial recovery rate of sulfur resorcinol lotion in microbial enumeration test

表2 小兒硫間苯二酚洗劑微生物計數檢查回收率比值Tab 2 Bacterial recovery rate of sulfur resorcinol lotion for infants in microbial enumeration test

3.2 控制菌檢查的驗證結果

兩種硫間苯二酚洗劑控制菌檢查的驗證試驗中，各批次加入的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均可檢出，供試品對照組和陰性對照組均未見菌生長。認為兩種硫間苯二酚洗劑采用1 : 10供試液制備和薄膜過濾法，進行預處理，培養條件和劃線培養方法進行控制菌檢查，適用性驗證合格。結果見表3（“+”表示試驗結果檢出控制菌；“–”表示試驗結果未檢出控制菌）。

表3 兩種硫間苯二酚洗劑控制菌檢查的驗證結果Tab 3 Validation results of controlled bacteria test in two kinds of sulfur resorcinol lotions

4 討論

4.1 醫院制劑微生物檢查的進展

醫院制劑存在單批次制備數量少，劑型復雜，品種分散等限制條件[3]。微生物檢查是制劑質量把控的重要內容，應根據藥典的變化及時更新檢查方法。和2010年藥典[4]比較，2015年版藥典需氧菌總數計數采用TSA培養基替代了營養瓊脂培養基；霉菌和酵母菌總數的計數采用SDA培養基替代了玫瑰紅鈉瓊脂培養基[5]。控制菌檢查選用TSB培養基替代營養肉湯進行預增菌。需氧菌計數的驗證菌種采用銅綠假單胞菌替代了2010版的大腸埃希菌，菌落形態更穩定，更適于培養基性能測試和方法適用性研究[6]。

4.2 供試品的前處理方法

本研究中的兩種硫間苯二酚洗劑屬于水不溶性非油脂類供試品，組分具有一定的抑菌作用，需要進行消除抗菌活性處理。混懸劑的樣品處理，以往多采用稀釋后低速離心，取上清液薄膜過濾，但離心棄沉淀的處理，導致藥品微生物計數檢查結果明顯偏低[7]，因此《中國藥典》2015年版已經刪除了離心沉淀法[8]。本研究將混懸劑樣品按照1 : 10的比例稀釋，薄膜過濾法進行前處理，能夠較好地去除抑菌作用，而且不會傷害樣品中可能含有的微生物。

4.3 間苯二酚含量的影響及其它因素

本研究中兩種洗劑的間苯二酚含量較低有助于減少不良反應[9]，硫間苯二酚洗劑中的間苯二酚含量為2%，小兒硫間苯二酚洗劑中的間苯二酚含量為1%。計數檢查結果提示間苯二酚含量的差異對微生物回收情況檢查的影響較小。另外，本研究采用了《中國藥典》2015年版許可的0.9%無菌氯化鈉溶液作為稀釋液和沖洗液，與之前推薦的蛋白胨溶液等比較，成本更低且獲取便利。

綜上，本研究兩種硫間苯二酚洗劑的微生物限度檢查方法經驗證，均符合《中國藥典》2015年版要求，可以為洗劑類藥品進行微生物檢查提供參考。

[1] 中華人民共和國衛生部藥政局.中國醫院制劑規范（西藥制劑第二版）[S].北京：中國醫藥科技出版社，1995：92，105.

[2] 國家藥典委員會.中國藥典（四部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：136-151.

[3] 王曉青，馬靜，劉皈陽.采用趨勢性分析法探討我院醫院制劑的定位和發展[J].中國藥物應用與監測，2012，9（3）：163-165.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄.

[5] 王娟，李兵蘭，許春，等.中國藥典2010年版和2015年版微生物計數檢查法比較[J].中國藥師，2017，20（9）：1687-1689.

[6] 楊曉莉，李輝，馬英英，等.中國藥典2015年版非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法解讀[J].藥物分析雜志，2016，36（6）：1101-1107．

[7] 張光華，鄭小敬，余立.離心棄沉淀處理對藥品微生物限度檢查結果影響的考察[J].中國藥物應用與監測，2007，4（2）：42-45.

[8] 國家藥典委員會.中國藥典分析檢測技術指南[S].北京：中國醫藥科技出版社，2017：568.

[9] 王莉，馬聰，雷嘉豪，等.基于中國醫院制劑規范的復方間苯二酚洗劑風險分析與控制[J].中國藥物警戒，2016，13（12）：733-736.