豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）新佐劑評(píng)估試驗(yàn)

秦守賢 孫 濤

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.申聯(lián)生物醫(yī)藥（上海）股份有限公司，上海 200241）

合成肽疫苗是一種僅含免疫決定簇組分的小肽，即用人工方法按天然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成保護(hù)性短肽，與載體連接后加佐劑所制成的疫苗，是最為理想的安全新型疫苗，也是目前研制預(yù)防和控制感染性疾病和惡性腫瘤的新型疫苗的主要方向之一。

佐劑是與抗原同時(shí)或預(yù)先注射，可非特異性地增強(qiáng)或改變機(jī)體對(duì)抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)，選擇合適的佐劑是疫苗免疫效果的保證。理想的佐劑應(yīng)能促進(jìn)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，也能作用于弱免疫性抗原，而且不引起有害的副作用，穩(wěn)定且便宜容易生產(chǎn)[1]。

合成肽疫苗是一種新型疫苗，具有免疫原性高、生物安全性好、免疫持續(xù)期長(zhǎng)、質(zhì)量穩(wěn)定性好、可有效區(qū)分免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物的特點(diǎn)[2]。由于合成肽抗原本身分子小，免疫原性弱，需用特定的佐劑來(lái)增強(qiáng)其免疫原性。目前，市場(chǎng)上口蹄疫疫苗所用佐劑主要包括ISA 201VG、ISA 206VG、ISA 50V和ISA 50V2，而豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）主要使用的佐劑為ISA 50V2。ISA 50V2佐劑投入生產(chǎn)近4年來(lái)，客戶對(duì)豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）的免疫效果持肯定態(tài)度，但也有市場(chǎng)反饋合成肽疫苗注射阻力較滅活疫苗大。疫苗的注射阻力和疫苗黏度息息相關(guān)，黏度過(guò)大可導(dǎo)致注射阻力增大，應(yīng)激反應(yīng)增大，降低免疫效果，同時(shí)也影響肉制品質(zhì)量。市場(chǎng)上ISA 50V2佐劑所制成的合成肽疫苗黏度一般在100cP左右，滅活疫苗的黏度一般在30cP左右，合成肽疫苗黏度較滅活大，可能會(huì)存在注射困難的現(xiàn)象。

低黏度、良好穩(wěn)定性、免疫效果好、無(wú)副作用一直是合成肽疫苗工藝改進(jìn)的方向。ISA 50V2佐劑的供應(yīng)商法國(guó)SEPPIC公司，為降低合成肽疫苗的黏度，研發(fā)成功了新佐劑ISA 61VG。本試驗(yàn)采用新佐劑ISA 61VG和原ISA 50V2佐劑進(jìn)行乳化制成豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800），試驗(yàn)新佐劑的乳化后的外觀、劑型、穩(wěn)定性和黏度是否能夠達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，其黏度是否能夠有效降低，并探討新佐劑替代現(xiàn)有佐劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水相：內(nèi)含合成肽抗原多肽2 6 0 0（批號(hào)為SL3150621B1D1）、多肽2700（抗原批號(hào)為SL2150621B1D1）和多肽2800（抗原批號(hào)為SL1150624B1D1）各25μg/ml，申聯(lián)生物醫(yī)藥（上海）股份有限公司生產(chǎn)；

1.1.2 佐劑：ISA 61VG佐劑，法國(guó)SEPPIC公司生產(chǎn)，批號(hào)為QP45781；ISA 50V2佐劑，法國(guó)SEPPIC公司生產(chǎn)，批號(hào)為QP27845；

1.1.3 儀器：FA25剪切乳化機(jī)，剪切頭（20g、10g），梅特勒-托利多AB204-S分析天平，NDJ-5S型黏度計(jì)，LS-POP（8）激光粒度分析儀。

1.2 方法

1.2.1 疫苗配制

（1）50V2佐劑：按現(xiàn)有的豬口蹄疫O型合成肽疫苗（2600+2700+2800）乳化工藝（水油體積比1：1、乳化流速7000ml/min）制成疫苗。乳化10次。

（2）61VG佐劑：根據(jù)前期61VG佐劑乳化參數(shù)的篩選試驗(yàn)所確定最優(yōu)的61VG佐劑乳化工藝參數(shù)（水油重量比1：1、乳化流速8000ml/min），使用61VG佐劑乳化制成疫苗。乳化10次。

1.2.2 檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)

（1）外觀：眼觀應(yīng)為乳白色略帶黏滯性乳狀液。

（2）劑型：油包水型（W/O）。取一潔凈吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，第一滴不計(jì)，從第二滴開(kāi)始，應(yīng)呈油滴狀不擴(kuò)散。

（3）穩(wěn)定性：取出待檢樣品回溫至室溫（15℃～25℃），吸取疫苗10ml 放入相應(yīng)的離心管中，于天平稱(chēng)量平衡后以3000r/min離心15min，管底析出的水相體積應(yīng)不得超過(guò) 0.5ml。

（4）黏度：取疫苗100ml，使用黏度計(jì)檢測(cè)，應(yīng)不大于150cP。

（5）粒徑：選取白油作分散劑，以疫苗：白油為1：8至1：12的比例稀釋?zhuān)鳛榇郎y(cè)樣品，使用LS-POP（8）激光粒度分析儀進(jìn)行檢測(cè)，D50應(yīng)為1.24～1.96μm。

2 結(jié)果

2.1 外觀

樣品目測(cè)均為乳白色略帶黏滯性液體，檢測(cè)結(jié)果均符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1）。

2.2 劑型

樣品檢測(cè)均為油包水型，檢測(cè)結(jié)果均符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1）。

2.3 穩(wěn)定性

樣品離心后管底目測(cè)均無(wú)水相析出，檢測(cè)結(jié)果均符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1）。

2.4 黏度

通過(guò)黏度計(jì)檢測(cè)，ISA 50V2制成的疫苗黏度均小于100cP，ISA 61VG制成的疫苗黏度均小于60cP，檢測(cè)結(jié)果均符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1）。

2.5 粒徑

通過(guò)激光粒度分析儀檢測(cè)，ISA 50V2粒徑的D50值為1.28～1.81μm，符合企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而ISA 61VG粒徑的D50值為1.74～2.07μm，不符合產(chǎn)品的企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

（1）ISA 61VG佐劑制成的豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）的外觀、劑型、穩(wěn)定性和黏度均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且ISA 61VG的黏度較ISA 50V2佐劑顯著降低。ISA 50V2佐劑制成豬口蹄疫O型合成肽疫苗（2600+2700+2800）的黏度檢測(cè)結(jié)果范圍為97.4～98.6cP，平均黏度為98.01cP；ISA 61VG佐劑制成豬口蹄疫O型合成肽疫苗（2600+2700+2800）的黏度檢測(cè)結(jié)果范圍為51.4～52.8cP，平均黏度為52.23cP，下降了47%，下降顯著（p＜0.01）。

表1 疫苗檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

（2）ISA 61VG佐劑的粒徑檢測(cè)結(jié)果不符合現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（D50范圍1.24～1.96μm）。由表3可以看出，ISA 61VG所制得疫苗的D50均值1.90μm比原有佐劑的D50均值1.67μm有所變化，現(xiàn)有的疫苗粒徑標(biāo)準(zhǔn)也是根據(jù)ISA 50V2佐劑制得疫苗的檢測(cè)結(jié)果所制定的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。粒徑檢測(cè)結(jié)果的變化是由工藝的原因?qū)е?，還是ISA 61VG佐劑本身粒徑就和ISA 50V2佐劑不一致，這需要后續(xù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行證明。

（3）從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，新佐劑ISA 61VG制成疫苗的黏度下降顯著，ISA 61VG佐劑替代現(xiàn)有佐劑有很大可行性，后續(xù)可開(kāi)展相關(guān)的動(dòng)物免疫試驗(yàn)，來(lái)綜合評(píng)定ISA 61VG佐劑。如能在降低疫苗的黏度的同時(shí)，有效地保證動(dòng)物免疫效果，該佐劑即為目前豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）所需的優(yōu)良佐劑。

（4）疫苗黏度影響因素包括佐劑種類(lèi)和用量、乳化時(shí)間、水油比等[3]，從本試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，疫苗黏度和粒徑也存在一定的關(guān)聯(lián)。本試驗(yàn)中疫苗黏度下降了47%，而粒徑D50值升高14%，可能具有一定的負(fù)相關(guān)。粒徑可作為疫苗工藝改進(jìn)的一個(gè)新思路，進(jìn)而探索乳化溫度控制、攪拌頻率、壓力等一系列乳化參數(shù)和粒徑的關(guān)系，有目的嘗試提高疫苗粒徑，來(lái)觀察能否達(dá)到降低疫苗黏度、提高疫苗質(zhì)量的效果。

[1] 潘杭君，孫紅祥.免疫佐劑的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志，2004，38（1）：32-37.

[2] 史素云，楊志彪.豬O型口蹄疫的新型合成肽疫苗和傳統(tǒng)滅活疫苗的比較[J].農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)與裝備，2015，（4）：54-56.

[3] 江心華，陳玉文.影響油乳劑疫苗黏度因數(shù)的探討[J].福建畜牧獸醫(yī)，2010，（2）：18-19.