應用蛋白質(zhì)組學技術篩選抽動障礙患兒不同中醫(yī)證型血清相關蛋白

王 端，賀 莉，張 婕，趙小艷，熊曉藩，賀文香，張海清，陳艷妮,

(1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712000；2.西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710000；3.西安交通大學，陜西 西安 710000)

抽動障礙(tic disorders,TD)是一種常于兒童時期起病，以不自主、反復、快速、無目的一個部位或多部位肌肉運動性抽動或發(fā)聲性抽動為主要臨床表現(xiàn)[1]，并可伴有注意力不集中、多動、強迫性動作或其他精神行為癥狀的慢性神經(jīng)精神疾病[2]。本病可歸屬于中醫(yī)學“慢驚風”、“瘛瘲”、“肝風”等范疇。關于抽動癥狀的描述最早可追溯到遠古時代，但關于抽動障礙的病因及發(fā)病機制至今仍不清楚，治療藥物也因副作用明顯而僅限于當抽動癥狀影響患兒或家長生活或?qū)W習時才予使用。目前認為TD具有明顯的遺傳傾向，但卻無法以常染色體顯性、隱性或性聯(lián)遺傳方式來解釋[3]，故多認為TD是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結果。蛋白組學技術作為后基因時代的一種重要方法，可提供疾病病理過程中豐富的生物學信息，有助于進一步揭示TD的發(fā)病機制及探尋治療靶點。本實驗采用磁珠結合、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(MALDI-TOF-MS)，對TD最常見證型氣郁化火證、脾虛痰聚證患兒及正常兒童血清蛋白組進行比較，得出差異血清蛋白，從蛋白質(zhì)水平揭示兒童TD的發(fā)病機制及不同中醫(yī)證型間的微觀物質(zhì)表達。

1對象與方法

1.1研究對象

所有研究對象均來源于2017年4至9月西安市兒童醫(yī)院兒?？崎T診，包括TD患兒60例(氣郁化火證34例、脾虛痰聚證26例)及同時期體檢無特殊疾病的健康兒童30例，分別作為TD組和健康對照組。本研究經(jīng)西安市兒童醫(yī)院倫理委員會批準，所有入組兒童監(jiān)護人均簽署知情同意書。各組年齡、性別比較均無統(tǒng)計學差異，見表1。

組別例數(shù)(n) 性別 男女年齡(歲)健康對照組3026(86.67)4(13.33)7.36±2.11TD組6052(86.67)8(13.33)7.46±2.23 脾虛痰聚證21(80.77)5(19.23)7.71±2.45 氣郁化火證31(91.18)3(8.82)7.26±2.06χ2/t1.1420.112P0.7030.947

1.2納入與排除標準

納入標準：TD組均符合美國《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊》第5版TD診斷標準[4]及《中醫(yī)兒科學》第9版TD氣郁化火證或脾虛痰聚證的證型標準[5]；18歲以下兒童，不限男女；無其它神經(jīng)精神類疾??；未服用過多巴胺受體阻滯劑、選擇性單胺能阻滯劑、多巴胺自身受體激動劑、中樞性α受體激動劑、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等影響神經(jīng)遞質(zhì)的藥物。排除標準：同時患有其它神經(jīng)精神類疾病的兒童；有服用多巴胺受體阻滯劑、選擇性單胺能阻滯劑、多巴胺自身受體激動劑、中樞性α受體激動劑、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等影響神經(jīng)遞質(zhì)的藥物史的兒童；多種中醫(yī)證型夾雜的患兒。

1.3材料及方法

1.3.1主要儀器及試劑

磁珠試劑盒：Profiling Kit 100 MB-WCX(貨號8223983)、基質(zhì)2-氰基-4羥基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinnamicacid，HCCA)、磁珠分離器、AnchorChipTM質(zhì)譜板、蛋白質(zhì)芯片飛行時間質(zhì)譜儀autoflex III smartbeam均購買自德國Bruker公司；采集軟件：flexControl 3.3；標峰軟件：flexAnalysis；統(tǒng)計軟件：Clinpro Tools。

1.3.2標本采集及處理

采集肘靜脈血3mL于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-k2)管中，搖勻，室溫下靜置2h，10℃、3 300r/min離心10min，取上層血清于EP管中，編號，保存于-20℃冰箱備檢。

1.3.3蛋白質(zhì)檢測

樣本處理：-20℃取出血清置于冰上融化。磁珠處理：①4℃冷藏儲存室取出WCX磁珠懸浮液，完全混勻1min；②取7μL磁珠置于200μL樣品管中，并加入10μL磁珠結合緩沖液(binding buffer，BB)，吹打20次混勻，再加入5μL樣本，吹打10次混勻，室溫靜置5min；③將樣品管放入磁珠分離器，使磁珠貼壁2min，液體澄清，棄上清液；④向樣品管中加入100μL洗脫液(wash buffer,WB)，在磁珠分離器中來回移動10次，靜置1min，棄上清液，共洗3次；⑤加入5μL洗脫液(elution buffer,EB)吹打20次混勻后使磁珠貼壁2min，轉移上清液至新管；⑥加入5μL穩(wěn)定液(stabilization buffer,SB)，混勻。點樣：吸取1μL的處理樣本至直徑600μL的AnchorChipTM質(zhì)譜板上，放置于室溫下，待干燥后吸取1μL 0.3g/L濃度HCCA溶液至滴有處理樣本的質(zhì)譜板孔中，置于室溫下干燥。上機：啟動autoflex III smartbeam布魯克質(zhì)譜儀，放入質(zhì)譜板，校正機器。應用flexControl 3.3采集軟件，每個樣本孔采集3次，以驗證穩(wěn)定性。應用flexAnalysis 3.3標峰軟件及ClinproTools統(tǒng)計軟件對蛋白波進行分析，選擇差異峰標準P<0.05，差異倍數(shù)>1.9，受試者工作特征曲線下面積(AUC)>0.7。

1.4統(tǒng)計學方法

2結果

2.1TD組與健康對照組血清蛋白比較

本研究60例TD組患兒與30例健康對照組共檢測蛋白峰64個，分析后發(fā)現(xiàn)，有5個不存在差異表達，有59個存在差異表達(P<0.05)，其中有8個蛋白峰存在顯著表達差異(P<0.01)，其中最大差異蛋白峰相對分子質(zhì)量(Mr)為6 642.05，差異倍數(shù)為3.24倍，最小差異蛋白峰Mr為2 293.11，差異倍數(shù)為1.98倍，見表2。

表 2 TD組與健康對照組差異蛋白峰

Table 2 Different protein peaks in TD group and healthy control group

2.2 TD氣郁化火證與脾虛痰聚證血清蛋白比較

本組患兒中，TD氣郁化火證與脾虛痰聚證血清蛋白比較，共檢測蛋白峰65個，有58個存在差異表達(P<0.05)，其中有2個顯著差異蛋白峰，見表3。

表3 氣郁化火證與脾虛痰聚證差異蛋白峰

Table 3 Different protein peaks in cases of syndrome of qi depression transforming into fire and cases of spleen deficiency leading to phlegm syndrome

3討論

3.1 TD與蛋白組學

TD是以抽動為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)精神疾病，因其慢性、波動性、多發(fā)性的特點[1]使患兒家長倍受困擾，其中的Tourette綜合征(TS)更因常共患其他神經(jīng)精神疾病而使患者生活質(zhì)量較健康兒童低[6]。目前對于該病的生化研究主要集中于對腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的研究，病因及發(fā)病機制并不明確，臨床診斷主要依靠描述性診斷并排除其他疾病，缺乏特異性診斷指標，臨床用藥也因副作用而表現(xiàn)出局限性[7]。蛋白組學技術的興起及逐漸成熟提供了新的思路及方法，已在很多疾病領域有所突破，是臨床醫(yī)學中成熟的診斷工具，但在TD方面的研究還很少。本研究通過蛋白組學技術初步研究了TD患兒與健康兒童及氣郁化火證與脾虛痰聚證TD患兒的血清蛋白質(zhì)表達情況，比較出差異蛋白峰。將所得差異峰分子量輸入uniprot數(shù)據(jù)庫，共檢索得到3個與神經(jīng)精神疾病最相關的蛋白，分別為鋅指蛋白神經(jīng)源分化因子4、γ-氨基丁酸受體亞基α-2、神經(jīng)源煙堿乙酰膽堿受體亞基α-5。

3.2 TD與健康兒童差異表達蛋白

3.2.1 TD與鋅指蛋白神經(jīng)源分化因子4

鋅指蛋白神經(jīng)源分化因子4(Zinc finger protein neuro-d4 )是由Buchman等于1992年克隆出的新基因neuro-d4編碼的一種新型鋅指蛋白。鋅指蛋白廣泛存在，在基因的表達調(diào)控中起重要作用，一些鋅指蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起作用[8]。Buchman等還發(fā)現(xiàn)與編碼其它鋅指蛋白的基因不同，neuro-d4特異性表達于神經(jīng)系統(tǒng)，而且似乎僅限于某些特定的神經(jīng)元中，原位雜交與印跡雜交結果均顯示：在周圍神經(jīng)系統(tǒng)(背根神經(jīng)節(jié))以及在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域(在大腦皮層、海馬、多個腦干核和小腦)中檢測到neuro-d4 mRNA。雖然，既往關于TD的研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)與鋅指蛋白神經(jīng)源分化因子4有關的直接證據(jù)，但該蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)的密切關系使研究人員很難相信其與TD間沒有聯(lián)系。而且，Buchman等的研究還發(fā)現(xiàn)編碼該蛋白的基因在成年鼠表達水平要低于胚胎末期及新生兒期，即生后逐漸下降，TD好發(fā)于兒童及青少年，較少見于成人，這也進一步驗證了鋅指蛋白神經(jīng)源分化因子4與TD的關系。但因本研究中研究對象年齡較為集中，不能形成明顯的年齡分層，故無法從該實驗中進一步驗證此說法。

3.2.2 TD與γ-氨基丁酸受體亞基α-2

γ-氨基丁酸受體亞基α-2(Gamma-amino￣butyric acid receptor subunit alpha-2)為γ-氨基丁酸受體的三級結構，γ-氨基丁酸(GABA)為腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA能神經(jīng)通路則為抑制性通路。研究表明TD兒童GABA能系統(tǒng)活動減弱，如Mondrup等于1985年研究發(fā)現(xiàn)，應用氟柳雙胺(一種新型GABA受體激動劑)治療TD患兒，患兒不自主運動有明顯減少。但與該蛋白分子量6 455相近的6 443.34蛋白峰在TD組中表達升高，與該理論不符，故本研究中所得差異蛋白并非γ-氨基丁酸受體亞基α-2。

3.2.3 TD與神經(jīng)源煙堿乙酰膽堿受體亞基α-5

神經(jīng)源煙堿乙酰膽堿受體亞基α-5(neuronal nicotinic acetylcholine receptor, alpha5 subunit ，nAChRα-5，又稱神經(jīng)源煙堿受體亞基α-5)為組成煙堿乙酰膽堿受體的一個亞基，煙堿-膽堿能神經(jīng)通路廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并對中樞神經(jīng)系統(tǒng)起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明煙堿受體與多種神經(jīng)性疾病相關[9]。近年來得益于神經(jīng)影像學的發(fā)展，大量研究已證實TD患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在解剖及功能異常，如Miller等[10]于2010年報道，TD患兒存在海馬、胼胝體、丘腦的發(fā)育異常；李秀麗等[11]于2010年通過彌散張量成像原理發(fā)現(xiàn)TD基底神經(jīng)節(jié)功能活動異常，并且與抽動的嚴重程度相關。而McPhillips 等(1988年)報道nAChR的激活與大腦各功能區(qū)域的發(fā)育成熟密切相關，故我們推測nAChRα-5可能通過影響神經(jīng)系統(tǒng)的成熟而導致TD。還有學者指出，nAChR可能對腦發(fā)育過程中谷氨酸(GLU)信號系統(tǒng)的發(fā)育成熟有重要影響[12]。GLU為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要內(nèi)源性神經(jīng)興奮物質(zhì)，GLU的主要受體之一使君子酸受體(AMPA)的數(shù)量決定突觸后神經(jīng)元的興奮程度，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸傳遞的主要影響因素。唐洪麗等于2002年通過高效液相色譜法測定TD患兒血漿GLU的水平發(fā)現(xiàn)明顯高于正常對照組，且與TD所致的部分心理行為相關。故nAChRα-5也可能通過影響GLU信號系統(tǒng)而在TD的發(fā)生中發(fā)揮作用。TD與乙酰膽堿系統(tǒng)的關系尚未完全闡明，Quik等[13]報道指出，nAChR激動劑尼古丁減輕了抽動穢語障礙的運動障礙癥狀，但Sarah等(2010年)則認為TD是由多巴胺系統(tǒng)與膽堿能系統(tǒng)失衡所致，即膽堿能系統(tǒng)減弱。兩種觀點相反，若本研究所得差異蛋白峰后續(xù)經(jīng)鑒定確為nAChRα-5，則對進一步研究TD與膽堿能系統(tǒng)的關系有一定的指導意義。

3.3 TD氣郁化火證與脾虛痰聚證差異表達蛋白

氣郁化火證與脾虛痰聚證TD患兒血清蛋白有2個差異蛋白峰，Mr為873.73、6 642.04，兩者均在脾虛痰聚證組高表達。同上，6 642.04蛋白峰所檢索出的蛋白為nAChRα-5。膽堿能系統(tǒng)與脾虛證之間的關系已被既往研究多次證實：陸佰榮等(2002年)運用免疫組化法探討膽堿能神經(jīng)與中醫(yī)脾虛證之間的關系，結果發(fā)現(xiàn)脾虛大鼠模型組免疫反應明顯增強；吳慧等[14]則直接將膽堿酯酶作為判斷生、熟白術之枳術丸對脾虛食積證模型鼠的作用比較。本研究中6 642.04蛋白峰ROC曲線下面積為0.746，具有較強的臨床診斷能力，但本研究所發(fā)現(xiàn)的中醫(yī)兩種證型間的差異蛋白峰較少，差異倍數(shù)也不及健康對照組與TD組間大，猜測可能與病例收集過程中中醫(yī)證型主要靠臨床醫(yī)生經(jīng)驗判斷，有一定的主觀性有關。6 642.04蛋白峰在TD患兒組高表達，同時又是中醫(yī)兩種證型之間的差異蛋白，故推測該蛋白不僅可能成為診斷TD的潛在指標，還可能成為區(qū)分兩種證型的潛在生物學標志物。對于改變以前僅靠臨床醫(yī)生個人經(jīng)驗區(qū)分證型，建立簡潔、高效、客觀、可重復的中西醫(yī)結合辨證體系有重要意義。

目前對于TD及其中醫(yī)相關證型蛋白組學研究較少，由于本研究尚處于初步研究階段，只發(fā)現(xiàn)了一些差異表達蛋白峰，尚未對差異蛋白進行鑒定及進一步研究。該研究所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白可能對TD發(fā)病機制研究、發(fā)現(xiàn)特異性診斷指標及靶向治療藥物的開發(fā)有一定的作用，并可能會為中醫(yī)不同證型發(fā)病機制進行闡釋、形成新的中西醫(yī)結合辨證體系、進一步建立中醫(yī)診斷模型有一定幫助，因此關于兒童TD蛋白組學仍需進一步研究。

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