無創產前DNA篩查在胎兒染色體非整倍體基因檢測中的臨床應用

付 佳 郭敬春 肖紀平 張 靜 周 林 張 華 郭云霄 侯慧麗李 霞

1.濟南大學 山東省醫學科學院醫學與生命科學學院(250200)；2.山東省醫學科學院基礎醫學研究所；3.山東省聊城市東昌府區婦幼保健院

染色體異常是導致出生缺陷的重要因素，在新生兒中的發生率為0.6 %[1-2]。最常見的染色體異常為染色體非整倍體異常，包括21-三體、18-三體、13-三體綜合征，以及一些性染色體非整倍體異常[3]。目前，鑒于此類疾病尚無有效的治療方法，只能通過產前篩查避免給家庭及社會帶來精神和經濟負擔。無創產前DNA篩查(NIPT)是一項使用孕婦外周血胎兒游離DNA進行深度測序的新興的產前篩查技術，具有安全、快速、有效、簡單、易于接受等優點，成為發展的新趨勢。本文通過回顧性分析1年來在本院產前診斷中心接受孕婦外周血胎兒游離DNA產前檢測隨訪資料， 探討NIPT在胎兒染色體非整倍體基因檢測中的臨床應用效果。

1 對象和方法

1.1 對象

2015年5月-2016年12月來本院產前診斷中心行NIPT產前檢測的孕婦共10 203例，年齡16～50歲，孕12～32周；對妊娠>22+6周的孕婦，告之錯過最佳產前診斷時間的風險，孕婦自愿要求進行孕婦外周血胎兒游離DNA產前檢測，并承擔檢測風險及因錯過最佳產前診斷時間所致無足夠時間進行后續臨床處理等后果。排除標準：①孕周<12 周；②夫婦一方有明顯的染色體異常；③1年內接受過異體輸血、移植手術、異體細胞治療等；④胎兒超聲檢查提示有結構異常須進行產前診斷；⑤有基因遺傳病家族史或提示胎兒罹患遺傳基因高風險；⑥孕期合并惡性腫瘤；⑦醫師認為有明顯影響結果準確性的其它情形。本研究經院倫理委員會審核同意，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1血液采集用Streck Cell-Free DNA BCT 管采集孕婦外周血10 ml，72h內于4℃離心15min分離血漿。血漿于4℃離心10min，上清血漿分裝至置2.0 ml EP管中，每管轉入600 μl血漿，標記樣品編號和血漿管數，立即放入-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 DNA提取采用MagPure Circulating DNA Kit 試劑盒對分離的血漿進行DNA提取。

1.2.3文庫構建、文庫定量用文庫構建試劑盒(博奧生物)，經末端修復、接頭連接和缺口修復、聚合酶鏈反應(PCR)等過程進行文庫構建；根據標準品和特定的程序，用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR) 對檢測的文庫進行定量分析。

1.2.4測序數據分析應用BES4000高通量測序平臺進行測序，應用晶芯無創產前數據分析管理軟件分析測序數據，得到21，18，13號染色體和其它染色體的Z值，根據每個樣品的Z值判斷樣本結果。

1.2.5胎兒染色體核型確診NIPT結果為高風險的孕婦，在簽署知情同意書前提下行介入性產前診斷，即采集胎兒羊水或臍血，經細胞培養后行染色體核型分析及高通量測序染色體微缺失微重復確定染色體異常情況。

1.2.6假陽性病例確診方法經與1例T18假陽性孕婦溝通，同意生產時留取胎盤組織，抽取臍血進行驗證，查找假陽性原因。對胎盤組織進行多點取樣，共取11個位點，每個位點取3個樣，抽取臍血2 ml。

1.2.7隨訪對篩查出的高風險孕婦進行產前診斷并追蹤回訪妊娠結局；低風險追蹤回訪，確認有無漏診病歷，以分析無創檢測方法的檢出率、假陽性率、假陰性率。

2 結果

2.1 NIPT結果分析

在接受NIPT的10 203例孕婦中，共篩查出高風險122例(1.2%)，包括21-三體33例(陽性率為0.3%)，18-三體15例(陽性率為0.2%)，13-三體3例(陽性率為0.03%)，性染色體異常25例(陽性率為0.3%)，其他染色體異常46例(陽性率為0.5%)。對篩查出染色體異常高風險孕婦進行產前診斷和追蹤回訪發現：①33例NIPT結果為21-三體孕婦介入性產前診斷檢測結果均顯示為21-三體；1例為46, XN；1例為45,XO[40]/46,XN[5]。其中31例選擇引產，1例NIPT為46, XN的孕婦和1例產前診斷為45,XO[40]/46,XN[5]的孕婦繼續妊娠，回訪述未見明顯異常。②15例NIPT為18-三體中，14例介入性產前診斷檢測結果均顯示為18-三體，均選擇引產；1例為46, XN(后面詳細描述)孕婦繼續妊娠，回訪述未見明顯異常。③3例NIPT為13-三體孕婦，介入性產前診斷結果為46, XN，繼續妊娠，回訪未見明顯異常。④25例性染色體異常中，12例介入性產前診斷結果均顯示性染色體異常，其中4例繼續妊娠，8例引產；7例介入性產前診斷均為46, XN，回訪繼續妊娠；另外3例拒絕接受羊水穿刺檢測；2例選擇繼續妊娠；1例選擇引產。⑤46例其他染色體異常孕婦中，有33例接受羊水穿刺，其中28例介入性產前診斷結果為46, XN；5例染色體微缺失微重復檢測異常，4例與NIPT結果一致，1例異常與NIPT結果不一致；13例拒絕羊水穿刺，回訪述未見明顯異常。⑤低風險隨訪：對10081例低風險孕婦進行電話隨訪，發現10080例胎兒出生均正常，1例胎兒發生20% T21嵌合。見表1。

表1 各染色體類型NIPT檢測分析

*有1例為21-三體20%嵌合歸于假陰性

2.2 無創產前檢測結果年齡段分析

對10 203例NIPT檢測孕婦年齡分析，孕婦年齡是胎兒發生染色體異常的風險因素，當孕婦年齡在26～35歲時，其NIPT檢測陽性率最低，胎兒發生染色體異常風險最低；隨著孕齡增加，特別是在>45歲時，胎兒發生染色體異常的風險會增加，見表2。

表2 NIPT檢測結果孕婦年齡分析[例(%)]

2.3 孕>22+6～32周NIPT檢測結果分析

NIPT檢測孕周>22+6～32周有329例，結果未檢測到高風險，產后孕婦回訪述未見明顯異常。

2.4 個例分析

對假陽性病例分析：臍血和臍帶3個點的胎兒核型結果均正常，但胎盤組織多個位置的檢測結果均與NIPT檢測結果一致，顯示18號染色體三體異常。其中：①胎兒面嵌合比例：邊緣點(68%)>中段點(60%)>中心點(10%)；②非胎兒面嵌合比例：中段點(69%)≈中心點(68%)>邊緣點(57%)。見表3。

表3 胎盤不同部位樣本染色體檢測

3 討論

出生缺陷是危害人類健康的三大疾病之一[4]，產前篩查和診斷是避免出生缺陷發生的關鍵步驟。在NIPT技術廣泛應用之前，臨床上一直采用血清學生化篩查及影像學檢查來完成對先天性缺陷的篩查，對于篩查結果為陽性的患者采取穿刺等侵入性產前診斷方法進行染色體分析。血清學篩查假陽性率高，導致很大一部分孕婦需要做介入性產前診斷，然而介入性產前診斷雖然陽性率高，但存在1%～3%的流產風險，給孕婦造成身心傷害。NIPT技術是建立在孕婦外周血中存在胎兒游離DNA這一科學依據上的[5]，以其無創、快速 、經濟和準確的優點備受歡迎[6]，但其只能作為產前篩查的一種方法。

NIPT是利用孕婦外周血胎兒游離DNA進行深度測序獲取胎兒染色體信息的方法，從而得出染色體數目異常風險程度的判斷。目前文獻報道稱孕婦外周血胎兒游離DNA檢測技術已可以成功檢測 21-三體、18-三體、13-三體綜合征及性染色體異常，靈敏度分別達到99.65%、99.66%、100.00%和 85.70%，特異性均達到99.00%以上[7-12]。大樣本臨床研究表明，NIPT檢測對 21-三體和 18-三體具有很高的敏感性，非常適用于21-三體和18-三體胎兒的初篩，對產前診斷的無創化具有很強的實用價值。對低風險隨訪，檢出1例21-三體20%嵌合,原因為鑒于目前NIPT技術局限性，無法檢測出這種低比例嵌合。本文研究結果表明NIPT對性染色體異常檢測和其他染色體的特異性和準確性均較低，但也突破了傳統的血清學不能篩查的弊端，相信不久NIPT會適用于更多的染色體疾病的篩查。

另外通過對接受NIPT檢測孕婦年齡分析，再次驗證了孕婦年齡是胎兒染色體異常的危險因素[13]。當孕婦年齡<25歲或>35歲時，其胎兒染色體異常的發生風險會增加。對檢測年齡的分析可見，≤20歲、>20～25歲比>25～40歲各年齡段的陽性率高，分析原因一方面是對于低年齡段行NIPT檢測，臨床指征大部分是孕中期血清學篩查為臨界風險或高風險的孕婦，而高年齡段的孕婦則直接選擇NIPT檢測，從而導致了低年齡段篩查陽性率高；另一方面可能是我們的臨床數據相對不足，會對結果的準確性產生影響。本研究初步探討了NIPT假陽性發生的原因，通過對1例T18假陽性患者胎盤組織及臍帶不同位點取樣和臍血進行檢測，發現胎盤組織取樣的結果與NIPT結果是一致，說明造成NIPT假陽性原因是胎盤組織的干擾，這一結論需要更大樣本的實驗數據驗證。

國家衛生計生委辦公廳關于規范有序開展孕婦外周血胎兒游離DNA產前篩查與產前診斷的通知中明確說到，NIPT的適用人群為12～22+6孕周，但也提到了適用人群包括血清學篩查臨界風險、有介入性產前診斷禁忌證、孕20+6周以上但錯過血清學篩查的最佳時間，但要求評估21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征風險者。因此對于孕>22+6周的孕婦，也可以在知情同意下行NIPT檢查，但需要知曉存在錯過最佳產前診斷時間的風險，孕婦自愿要求進行孕婦外周血胎兒游離DNA產前檢測，并承擔檢測風險及因錯過最佳產前診斷時間所致無足夠時間進行后續臨床處理等后果。總之，孕婦外周血胎兒游離DNA產前檢測對21-三體、18-三體有較高的特異性和準確性，而對性染色體和其他染色體的特異性和準確性較低。