希特林缺陷所致新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥家系基因分析

葉峻杰 管志福 楊景暉 孫麗娟 杜應(yīng)雄 張 樂

1. 云南省人口和計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，國家衛(wèi)生計生委西部孕前優(yōu)生重點實驗室，云南省生育調(diào)節(jié)與少數(shù)民族優(yōu)生重點實驗室(昆明，650021)；2. 云南省西雙版納傣族自治州人民醫(yī)院；3. 云南省第一人民醫(yī)院，昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院；4. 重慶市人口和計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，國家衛(wèi)生計生委出生缺陷與生殖健康重點實驗室

新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥(NICCD)是一類以血中直接膽紅素升高為主要表現(xiàn)，伴或不伴肝脾腫大的新生兒常見的病癥之一，其發(fā)病率約為1/2500[1]。近年來由于國內(nèi)對遺傳代謝病認(rèn)識及診斷水平的提高，希特林蛋白缺陷已成為NICCD的主要病因之一[2]。在臨床診療中是僅次于甲基丙二酸尿癥位居第二位的新生兒遺傳性代謝病[3]，患兒通過飲食調(diào)整及對癥治療，多數(shù)能取得良好效果，3%病情嚴(yán)重患兒需進行肝移植[4]。由于NICCD的臨床癥狀缺乏特異性，容易被以ABO血型不合溶血、感染、圍生等因素導(dǎo)致的新生兒高膽紅素血癥混淆，鑒別困難，其確診需要進行編碼希特林蛋白的SLC25A13基因突變檢測。本研究對一個希特林缺陷癥合并ABO血型不合溶血性黃疸的患兒家系進行SLC25A13基因突變分析，為臨床早期明確病因和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

患兒，男，漢族，出生8d，血型RH陽性A型，以診斷“新生兒高膽紅素血癥”入院治療。母親，白族，血型O型，孕期無異常。父親，漢族，血型不詳。患兒血液常規(guī)檢測為紅細胞4.18×1012/L[正常參考值(6.00～7.00)×1012/L]，血紅蛋白145 g/L(正常參考值170～200g/L)，紅細胞抗體放散試驗陽性；生化檢測顯示血清總膽紅素(263.7μmol/L)、直接膽紅素(18.2μmol/L)、間接膽紅素(245.5μmol/L)、總膽汁酸(62.2μmol/L)、堿性磷酸酶(245.0U/L)、乳酸脫氫酶(389.0U/L)、降鈣素原(1.2ng/ml)升高和總蛋白(47.0g/L)、白蛋白(30.0g/L)、膽堿酯酶(4417U/L)降低。根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)和以上檢查結(jié)果主要診斷為“新生兒ABO溶血性黃疸”給予對癥治療。遺傳性代謝病的串聯(lián)質(zhì)譜檢測為瓜氨酸(240.5μmol/L)、精氨酸(33.9μmol/L)、甲硫氨酸(51.4μmol/L)、苯丙氨酸(125.2μmol/L)、酪氨酸(490.7μmol/L)、瓜氨酸/苯丙氨酸比值(1.9)升高，提示NICCD，給予無乳糖和富含中鏈脂酰肉堿的配方奶粉喂養(yǎng)，病情得到改善。3個月后肝功能基本正常。患兒父母否認(rèn)肝病史、近親結(jié)婚史、家族遺傳史、不良孕產(chǎn)史。

1.2 方法

取患兒及其父母外周血2 ml，EDTA抗凝后采用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒提取基因組DNA。采用等位基因特異PCR法(AS-PCR/ARMS)，熒光標(biāo)記復(fù)合擴增聯(lián)合毛細管電泳片段分析檢測SLC25A13基因型。選取希特林缺陷癥相關(guān)的SLC25A13基因10個單核苷酸變異(SNV)(在中國人群中，這10個致病變異在希特林缺陷癥已知致病變異中占90%以上[5])，采用等位基因特異性引物進行擴增，同一變異位點不同基因型以片段長度進行區(qū)分。熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，通過毛細管電泳檢測擴增產(chǎn)物，GeneMapper software 5軟件分析基因位點的基因型。10個SNV位點的基本信息見表1。用Sanger測序驗證檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

用等位基因特異性引物法進行PCR擴增后野生型和突變型的長度如表2所示。擴增產(chǎn)物通過毛細管電泳進行分離，基因分型結(jié)果以不同長度的擴增產(chǎn)物峰呈現(xiàn)，如圖1。每個峰下面的3行數(shù)字分別表示檢測產(chǎn)物長度(bp)、峰高度、峰面積。SLC25A13基因10個突變熱點毛細管電泳片段分析結(jié)果顯示：患兒在CT8處有一個峰，長度為216 bp，為c.851_854del4突變純合子(圖1A)；患兒父母在CT8處均有兩個峰，長度分別為216bp和220 bp，兩人均為c.851_854del4突變攜帶者(圖1B和圖1C)。Sanger測序進一步驗證了毛細管電泳片段分析的結(jié)果：患兒SLC25A13基因反向測序和正常人序列對比顯示缺失4bp，且為純合缺失(圖2A)；患兒父母正向測序和正常人序列對比顯示SLC25A13基因缺失4bp，且為雜合突變，測序結(jié)果出現(xiàn)重疊峰(圖2B，圖2C)。

表1 SLC25A13基因10個SNV位點的基本信息

圖1 SLC25A13基因毛細管電泳片段分析結(jié)果(1A～1C分別為患兒、患兒父親、患兒母親圖譜)

A：患兒(純合子)B:患兒父親(雜合子)C:患兒母親(雜合子)

3 討論

希特林是位于染色體7q21.3的SLC25A13基因編碼的線粒體內(nèi)肝型天冬氨酸/谷氨酸載體(AGC)蛋白質(zhì)，其分子量為74000(675 個氨基酸)，在尿素循環(huán)及其他代謝過程中發(fā)揮重要作用[6]。希特林將線粒體內(nèi)的天冬氨酸轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)內(nèi)，參與尿素、蛋白和核酸的合成。同時希特林與蘋果酸-天冬氨酸穿梭耦聯(lián)，將細胞質(zhì)中糖酵解生成的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)還原當(dāng)量運至線粒體內(nèi)，維持NADH/NAD+比值的穩(wěn)定。當(dāng)SLC25A13基因突變致希特林缺陷時，尿素循環(huán)受阻、蛋白質(zhì)合成減少，患者表現(xiàn)為高氨血癥、瓜氨酸血癥和低蛋白血癥。NICCD患兒的臨床癥狀主要表現(xiàn)為黃疸、肝功能異常、伴或不伴肝腫大等，以及由于代謝異常所引起的多種生化指標(biāo)異常，部分患兒有凝血功能異常、半乳糖血癥[7]。

本例患兒出生后8d以高膽紅素血癥、母乳喂養(yǎng)困難就診，入院經(jīng)血液、生化檢查發(fā)現(xiàn)母子血型不合和總膽紅素及間接膽紅素升高外，伴有直接膽紅素升高，血清總膽汁酸升高，堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、降鈣素原升高，血清蛋白和膽堿酯酶降低，瓜氨酸、精氨酸升高，經(jīng)SLC25A13基因突變檢測確診為NICCD合并新生兒ABO血型不合溶血性黃疸。ABO血型不合導(dǎo)致的新生兒高膽紅素血癥在臨床上很常見，與NICCD鑒別診斷為此高膽紅素血癥由溶血性黃疸引發(fā)，實驗室輔助檢查以血紅蛋白降低、ABO血型不合、紅細胞抗體放散試驗陽性和間接膽紅素升高等溶血性黃疸指標(biāo)異常為主；NICCD以肝性和膽汁淤積性黃疸為主，常規(guī)實驗室輔助檢查除血紅蛋白降低、總膽紅素升高以外，以直接膽紅素、血清總膽汁酸、降鈣素原升高和血清蛋白、膽堿酯酶降低為主要特征，進一步通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查瓜氨酸、精氨酸升高就可以做出臨床診斷。NICCD直接膽紅素升高的癥狀容易被總膽紅素升高所掩蓋，如不能及早診斷，將影響患兒的治療及預(yù)后。隨著近年來新生兒遺傳性代謝病研究不斷深入，不斷提高的串聯(lián)質(zhì)譜和基因檢測技術(shù)對NICCD的診斷起到了至關(guān)重要的作用。

SLC25A13基因純合或復(fù)合雜合子突變導(dǎo)致希特林蛋白缺失或合成減少。目前發(fā)現(xiàn)的該基因等位基因突變體與臨床癥狀相關(guān)的有40多種[8-9]，其中10個SLC25A13基因突變位點(c.851_854del4、c.615+5G>A、c.1638_1660dup23、g.IVS16ins3kb、c.1399C>T、c.955C>T、g.1592G>A、c.754G>A、IVS11+1G>A、c.1092_1095delT)與臨床表型密切相關(guān)，尤其是c.851_854del4、c.615+5G>A、c.1638-1660dup23和g.IVS16ins3kb這4個突變位點在中國人群中占所有突變的90%以上[5]。目前SLC25A13基因突變檢測大多采用對18個外顯子及相鄰序列擴增后PCR-RFLP或者直接測序的方法，但對于大片段剪切、缺失突變判別困難，而采用全基因組二代測序方法費用較高。本研究針對上述10個基因突變位點，應(yīng)用等位基因特異性引物擴增方法，參照Little的方法增加了人為錯配堿基以加強引物的特異性[10]，將點突變轉(zhuǎn)變?yōu)槠伍L度多態(tài)，10個基因位點經(jīng)熒光標(biāo)記引物復(fù)合擴增后，運用毛細管電泳分析加強片段的分辨率。實驗流程快速經(jīng)濟，結(jié)果類似于短串聯(lián)重復(fù)(STR)基因座片段分析，圖譜簡單直觀，易于臨床實驗室推廣[11]。

希特林缺陷癥呈世界性分布，以東亞地區(qū)為主。Kobayashi等[12-14]報道日本、韓國、中國健康人群SLC25A13 基因突變攜帶率分別為1/69，1/112，1/65。由于希特林缺陷癥為常染色體隱性遺傳病，只有SLC25A13基因純合或復(fù)合雜合子突變才能表現(xiàn)出顯著的臨床癥狀。研究東亞人群遷移結(jié)果顯示c.851_854del4突變位點的起源大概在云南和廣西地域[9,15]。本研究中患兒為c.851_854del4突變純合子，患兒母親為白族，父親為漢族，均為c.851_854del4突變雜合子攜帶者，通過家系的基因篩查和遺傳咨詢不僅為新生兒疾病篩查提供有效的途徑，而且為生育二孩的產(chǎn)前診斷打下基礎(chǔ)。

NICCD的臨床表現(xiàn)多樣且缺乏特異性，臨床上在沒有明確病因情況下通常采用對癥治療。患兒的癥狀因肝內(nèi)甘油-3-磷酸脫氫酶活性增高大多會在1歲內(nèi)緩解[16]，但遠期預(yù)后及治療缺乏大樣本的調(diào)查結(jié)果，因此通過SLC25A13 基因突變檢測和患兒家系篩查，可以進行針對性干預(yù)治療，改善患兒生存質(zhì)量，同時為再生育出生缺陷二級預(yù)防提供依據(jù)。