妊娠期糖尿病患者血清miR-222和雌激素受體-α表達的臨床意義

郭艷娟 趙楠楠 鄒 歌 常 慧 王 淼

華北理工大學附屬醫院(唐山，063000)

妊娠期糖尿病無明顯臨床癥狀但易增加圍產兒與產婦死亡率[1]。其發病原因主要與孕婦血糖持續增加、激素分泌減少引起糖代謝異常等多種因素相關，同時還與孕婦的體質密切相關[2]。尋求可預測孕早期妊娠期糖尿病發生的生物學標志對診療具有重要意義。miRNAs是一類內源性非編碼小RNA分子，可通過降解靶基因或抑制靶基因翻譯參與mRNA轉錄后調控，miRNAs異常表達與胎盤發育不良等妊娠相關疾病的發生發展密切相關[3]。有研究表明miR-222可通過調控靶基因雌激素受體α(ERα)下調而參與子宮內膜癌的雌激素治療[4]。目前關于妊娠期糖尿病患者血清miR-222、ERα表達水平研究較少，因此本研究主要探討血清miR-222、ERα表達的相關性及與臨床指標關系，為早期臨床診斷與治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年8月-2017年8月本院治療并分娩的妊娠期糖尿病患者為觀察組，另選取同期本院產檢并分娩的血糖正常孕婦為對照組。納入標準：①妊娠期糖尿病患者符合IADPSG診斷標準[5]；②無其他產科并發癥。排除標準：①多胎妊娠；②妊娠前患有高血壓、糖尿病等慢性疾??；③內分泌疾??；④患惡性腫；⑤孕期患有嚴重肝腎功能損傷與心血管疾病。

1.2 血清miR-222、ERαmRNA檢測

采用qRT-PCR法， RNAeasy extraction Kit試劑盒(Qiagen 公司)提取血清RNA，運用Nanodrop 2000核酸分光光度計(Thermo 公司)測定RNA。取2 μg RNA采用反轉錄試劑盒(Genecopeoia 公司)反轉錄為cDNA。qRT-PCR反應體系共20 μl，SYBR Green 10 μl，上下游引物各0.2 μl，10倍稀釋cDNA1 μl，RNase-free H2O 8.6μl。其中血清miR-222以U6為內參基因，ERα以β-actin為內參基因，引物序列詳見表1。每個樣品設置3個生物學重復，在熒光定量PCR儀上進行反應，反應程序95℃ 5min；95℃ 30s、60℃ 30s，72℃ 2min，共40個循環；72℃延伸10min。反應結束對所得數據Ct值分析，采用2-ΔΔCt算法計算miR-222和ERαmRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 ERα蛋白表達檢測

Western blot檢測。抽取孕婦空腹靜脈血 3 ml離心取血清于抗凝試管中，加入蛋白裂解液，玻璃勻漿器勻漿至組織破碎并冰上裂解30 min，離心5 min將上清轉移另一EP管中即組織總蛋白產物，采用BCA法檢測蛋白純度;并取20 μg蛋白樣品于沸水煮5 min后行SDS-PAGE凝膠電泳并電轉移至PVDF膜。封閉并加入ERα一抗(1:2000)室溫120 min，清洗后加入二抗室溫孵育60 min，再次清洗。采用ECL發光試劑盒發光顯影并運用Quantity One(美國BIO-RAD公司)分析軟件對條帶灰度值進行分析，以β-actin為內參對顯影條帶計算ERα蛋白相對表達量。

1.4 觀察指標

觀察兩組孕婦臨床指標，即體質指數(BMI)，空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、血清總膽固醇(TC)及甘油三脂(TG)。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 兩組孕婦一般資料比較

觀察組100例，年齡(32.2±3.6)歲(25～38歲)，孕(27.0±3.0)周(24～28周)；對照組100例，年齡(31.2±3.3)歲(23～37歲)，孕(26.9±2.9)周(23～27周)；兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。觀察組BMI(24.2±4.2 kg/m2)高于對照組(20.3±4.6kg/m2)(P<0.05)。

2.2 兩組臨床檢測指標比較

觀察組FPG、FINS均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組臨床檢測指標比較±s)

*與對照組比較P<0.05

2.3 兩組血清相關蛋白表達水平比較

兩組孕婦血清miR-222、ERαmRNA表達水平具有差異，其中觀察組血清miR-222表達量(2.69±0.32)高于對照組(1.15±0.08)， ERαmRNA表達量(0.31±0.09)低于對照組(1.12±0.15)(P<0.05)。見圖1。

2.4 兩組ERα蛋白表達檢測

Western法檢測ERα蛋白表達結果見圖2。觀察組 ERα蛋白表達水平(38.3±4.7)%低于對照組(99.5±8.4)%(P<0.05)。

A：觀察組miR-222；B：對照組miR-222；C：觀察組ERα；D：對照組ERα圖1 miR-222、ERαPCR產物電泳圖

圖2 兩組孕婦ERα蛋白表達水平

2.5 血清miR-222、ERα與臨床指標相關性分析

觀察組miR-222與臨床指標(BMI、FPG、FINS、TC)均呈正相關(P<0.05)，ERα與FPG呈負相關(P<0.05)，見表3。Pearson相關性分析顯示，血清miR-222與ERαmRNA表達水平呈負相關(P<0.05)。見圖3。

表3 臨床指標與血清miR-222、ERαmRNA相關性分析

圖3 血清miR-222與ERα表達相關性分析

2.6 觀察組血清miR-222、ERαmRNA表達與新生兒預后關系

根據血清miR-222檢測結果的中位值分為高表達組(67例)和低表達(33例);ERαmRNA表達量的中位值分為高表達組(36例)和低表達組(64例)。觀察組血清miR-222、ERαmRNA表達與新生兒預后的關系結果顯示，血清miR-222表達與早產、病理性黃疸相關，ERαmRNA表達與新生兒病理性黃疸相關(均P<0.05)。詳見表4。

表4 觀察組血清miR-222、ERαmRNA表達與新生兒預后的關系 [例(%)]

3 討論

妊娠期糖尿病具有較高的發病率，可增加孕婦及新生兒患糖尿病及心血管疾病的風險[6]。孕婦體內高血糖能抑制胚胎正常發育并處于胰島素抵抗狀態，若不及時診治，則導致胎兒先天畸形或引起流產，甚至發展為代謝性及心血管疾病[7]。目前臨床采用多種預防手段但效果不明顯，很多患者在確診時已處于孕晚期[8]。早期診斷有助于治療妊娠糖尿病并提高孕婦及胎兒的預后，因而需尋找孕早期診斷該病的生物學標記物。研究表明miRNAs可通過調控下游靶基因表達進而參與心血管病變、自身免疫性疾病等許多疾病的發生過程，可作為預測疾病的重要標記物[9]。探究妊娠期糖尿病患者血清miRNAs表達對研究妊娠糖尿病發生發展具有重要意義。

miR-222不僅參與細胞分化及凋亡等生物過程，同時能通過調控靶基因異常表達而參與惡性腫瘤細胞增殖及遷移過程[10]。有研究表明，血漿miR-222可通過改變基因表達水平促進乳腺癌細胞的增殖及遷移且高度表達[11]。同時還可參與女性相關疾病，miR-222在女性陰道壁中高表達而降低雌激素敏感性，改變陰道及盆腔組織結構，造成陰道前壁松弛[12]。同時miR-222具有高度保守性并可參與人類重要的生物學過程[13]。目前關于血清miR-222在妊娠糖尿病中的表達水平研究相對較少，本研究妊娠糖尿病患者血清miR-222水平高于對照組，推測miR-222參與了妊娠期糖尿病發生發展。此外，比較兩組孕婦臨床指標顯示，妊娠期糖尿病孕婦BMI、FPG、FINS均高于對照組，與管小芳等研究結果相似[14]。將血清miR-222表達與患者臨床指標進行相關性分析顯示，miR-222與BMI、FPG、FINS及TC均呈正相關，表明miR-222表達與臨床指標變化緊密相關，推測miR-222可能作為臨床診斷本病的重要指標。根據miR-222檢測結果的中位值將妊娠期糖尿病患者分為高表達組、低表達組，分析其與新生兒預后的關系顯示，miR-222高表達與早產、病理性黃疸相關，說明miR-222高表達時可引起新生兒早產及病理性黃疸。

ERα可與激素發生特異性結合促激素發揮生物學效應，同時還可影響細胞分裂、增殖或凋亡[15]。相關研究表明，ERα可通過改變雌激素水平引發子宮內膜息肉[16]。基于此，探究上游調控ERα表達的相關miRNAs對提高體內雌激素水平及臨床治療具有重要意義。有研究表明，miR-222可下調靶基因ERα表達參與浸潤性乳腺癌發生過程[17]。妊娠糖尿病患者中miR-222是否通過調控靶基因ERα表達而降低孕婦體內雌激素水平引發疾病，本研究妊娠糖尿病孕婦ERαmRNA表達量及ERα蛋白表達均低于對照組，說明ERα在妊娠糖尿病孕婦中下調表達，推測其可能參與妊娠糖尿病發生過程。觀察妊娠糖尿病孕婦ERα表達與臨床指標的關系顯示，ERα與FPG呈負相關，miR-222與ERα呈負相關，說明miR-222可能通過下調ERα表達參與妊娠糖尿病發展過程。根據ERαmRNA表達量中位值將妊娠糖尿病患者分為高表達組、低表達組，ERα低表達與新生兒病理性黃疸相關，說明ERα低表達時可引起新生兒病理性黃疸。本研究結果揭示miR-222上調表達可能引起妊娠糖尿病患者ERα下調表達參與發病過程，二者均與新生兒預后相關，可能作為妊娠糖尿病臨床診斷、病情評估及指導治療的重要指標。

綜上所述，妊娠期糖尿病患者血清miR-222上調表達， ERα下調表達，二者呈負相關且均與患者臨床指標及新生兒預后緊密相關，可為臨床診斷及靶向治療提供新思路。本研究存在不足之處，尚需進一步探究miR-222與ERα表達的具體調控機制。