多囊卵巢綜合征患者血清miR-21表達與肥胖和糖脂代謝的關系

白愛紅 滕少俠 謝文燕 李榮香 胥 博 付秀虹

河南省漯河市中心醫院(462000)

多囊卵巢綜合征(PCOS) 是內分泌代謝紊亂性疾病[1]，早期表現為多囊卵巢，雌激素下降、雄激素上調而出現的一系列高雄激素綜合征,晚期增加癌癥、2型糖尿病、心血管疾病的風險[2]。體質量指數(BMI)>23 kg/m2的女性PCOS患病率增高[3-4]。PCOS會產生一系列的代謝障礙，有研究顯示肥胖人群外周血miR-21表達與正常體重人群存在顯著差異，miR-21被證實在糖脂代謝中有重要作用[5-6]。然而目前PCOS肥胖、糖脂代謝與miR-21表達的關系尚存爭議，鑒于此本研究檢測PCOS患者外周血清miR-21，探討其表達與肥胖和糖脂代謝的關系。

1 資料與方法

1.1 資料來源

2016年2月-2017年12月本院生殖醫學與遺傳中心就醫的PCOS患者為研究對象(觀察組)，選擇同期因輸卵管或男性因素就診的不孕癥患者為對照組。觀察組患者診斷符合2003版鹿特丹PCOS診斷標準[7]。排除因其他疾病所致的雄激素增多癥(如先天性腎上腺皮質增生癥、庫欣綜合征等)；近3個月服用激素類藥物。對照組月經周期規則，基礎體溫雙相，B超檢查排除卵巢生理性囊腫、黃體囊腫或卵巢腫瘤等，近3個月未服用激素類藥物。

1.2 標本的采集

于月經周期第3～5d清晨采集兩組空腹靜脈血5ml，閉經且排除優勢卵泡及生理性囊腫者不限制采血時間，離心取上清液， -20℃低溫待檢。

1.3 miR-21檢測

1.3.1試劑與材料Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，定量7500 PCR儀購自美國ABI公司，逆轉錄系統購自美國GIBICOL公司。引物設計軟件為Primer Premier 5.0，引物合成由金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3.2 RNA提取用淋巴細胞提取液提取淋巴細胞，加1ml TRIzol試劑將標本勻漿處理，室溫放置5min；待核酸蛋白復合物完全分離后，2～8℃10000×g離心10min取上清，加入0.2ml氯仿振蕩15s，室溫放置3min；2～8℃10000×g離心15min，取無色水相層，異丙醇沉淀水相中RNA；2～8℃ 10000×g離心10min取沉淀物，75%乙醇洗滌RNA沉淀，2～8℃ 7500×g離心5min；棄上清，室溫放置RNA沉淀物至干燥，紫外分光光度法鑒定RNA純度和完整性。

1.3.3 RNA反轉錄反應(RT-PCR) Reverse Transcription Kit將RNA逆轉錄為cDNA，利用實時定量PCR系統進行RT-PCR反應，行瓊脂糖凝膠電泳，以U6分別作為miRNA的內參為對照，紫外燈下觀察結果。2-ΔΔCt法計算miR-21相對表達量。RT-PCR反應條件：95℃ 30 s，95℃ 15 s，72℃ 15 s，共40個循環，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 觀察及檢測指標

BMI檢測參照 WHO2000年國際肥胖特別工作組提出的亞太地區標準≥25kg/m2為肥胖[8]。全自動化學發光免疫分析儀(美國拜耳Centaur公司)測定空腹血糖 (FPG)和空腹胰島素(FINS)，并采用穩態模型法計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=(FPG×FINS)/22.5；Synchron LX20全自動生化檢測儀(美國 Beckman Coulter 公司)檢測三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 兩組患者一般情況

觀察組96例，對照組60例。觀察組年齡(46.8±5.6歲)及BMI(24.2±2.0 kg/m2)與對照組(45.0±6.9歲、24.5±18.5 kg/m2)比較無統計學差異(t=0.516、0.782，P=0.128、0.487)。

2.2 兩組患者血清miR-21表達差異

觀察組血清miR-21水平(2.7±0.7)高于對照組(1.1±0.3)(t=17.305，P=0.000)。

2.3 觀察組不同體重患者血清miR-21表達

觀察組中，PCOS合并肥胖患者血清miR-21(2.9±0.8)高于PCOS正常體重患者(1.8±0.4)(t=8.524、P=0.000)。

2.4 觀察組不同糖脂代謝患者生化指標

觀察組中，PCOS合并糖脂代謝異常患者血清TG、TC、HDL-C、HOMA-IR均高于糖脂代謝正常患者(P<0.05)，LDL-C低于糖脂代謝正常患者(P<0.05)，見表2。

表2 觀察組中代謝不同組生化指標差異±s)

2.5 觀察組不同糖脂代謝患者miR-21表達

觀察組中，PCOS合并糖脂異常組患者miR-21(42例，2.8±0.7)均高于PCOS糖脂代謝正常組(54例，1.5±0.2)(t=12.892 、P=0.000)。

2.6 miR-21與肥胖及相關指標相關性

miR-21與LDL-C、HOMA-IR 、BMI，觀察組均呈正相關(P<0.05)，對照組未發現有相關性。見表3。

表3 兩組miR-21與各觀察指標相關性分析

3 討論

miR-21是在人體組織廣泛存在的miRNAs之一。miR-21與靶基因信使RNA的3'非翻譯區(UTR)特異性結合使信使RNA降解轉錄，從而調控基因表達；同時miR-21含有獨立的啟動子，表達水平不受重疊的蛋白編碼基因啟動子調控[9]。已有研究報道，卵巢細胞中的microRNA通過作用于卵巢顆粒細胞，參與調節性腺發育、甾體類激素合成，促進卵細胞凋亡、排卵和黃體形成[10-12]。本研究結果，PCOS患者外周血清miR-21水平明顯高于正常孕婦，提示miR-21在PCOS的發生機制中扮演了重要角色。探討miR-21與PCOS的關系，對了解 PCOS分子遺傳學機制及治療均有較大價值，但是目前有關miR-21與PCOS研究較少，miR-21在PCOS的發生機制尚不十分明確。

在PCOS中肥胖、高雄激素、高胰島素三者相互產生不良作用，互為因果。許偉偉[8]等研究顯示，肥胖PCOS患者外周血清miR-21的表達高于非肥胖PCOS患者，且肥胖PCOS患者在控制體重后血清miR-21表達明顯下調，提示miR-21可能參與PCOS肥胖進程。本研究PCOS合并肥胖患者血清miR-21水平高于PCOS體重正常者，說明高表達的miR-21是PCOS肥胖的主要促進因素。許偉偉[8]對miR-21與睪酮、空腹胰島素進行相關性分析顯示，miR-21與睪酮、空腹胰島素水平呈正相關，推測 miR-21可能參與了 PCOS高雄激素血癥、高胰島素血癥的進程。有研究顯示，38%～88%的PCOS患者存在肥胖或超重，而肥胖、胰島素抵抗和PCOS之間又存在相互作用，肥胖的PCOS患者更易發生胰島素抵抗[13]，脂肪組織中mi-RNA的異常表達與葡萄糖及脂肪代謝有關[14-15]。本研究顯示，PCOS合并糖脂代謝異常患者血清miR-21的表達高于PCOS糖脂代謝正常患者，提示miR-21同樣參與了PCOS糖脂代謝異常的進程。通過對PCOS患者外周血清miR-21與肥胖、糖脂代謝指標的相關性分析顯示，miR-21與BMI、LDL-C、HOMA-IR均存在顯著正相關，說明糖脂代謝異常、肥胖的發生均與miR-21有關。有動物研究顯示，2型糖尿病大鼠模型中脂肪組織mi-RNA表達上調，高水平的葡萄糖和胰島素刺激脂肪組織表達miRNA導致了胰島素抵抗，miRNA與血糖水平呈劑量倍增關系[16]。

綜上，miR-21在PCOS肥胖、糖脂代謝異常進程中有重要作用，但miR-21如何調控膽固醇合成改變、脂肪細胞功能障礙、胰島素抵抗等機制尚不清楚，仍需更深入研究。由于本研究樣本較少，未對miR-21下游靶基因、作用途徑進行研究，今后將繼續開展機制研究，為臨床PCOS診斷提供更精確的病理生理學參考，以實施個性化治療。