糖尿病患者miRNA-29水平與胰島素抵抗的相關性

羅 艷 胡桂英 李長勇

(武漢市普仁醫院，湖北 武漢 430081)

糖尿病(DM)前期指的是一種異常血糖水平，特點為糖耐量減低(IGT)或空腹血糖受損(IFG)，是DM易感者發展為顯性2型DM(T2DM)的病理發展過程〔1〕。DM前期發病率非常高，胰島素敏感指數(ISI)發生變化，而且發展為DM的風險遠高于健康人群，若能在此期進行監測、有效延緩或甚至逆轉這種異常狀態，可能在DM防治中具有重要意義〔2〕。miRNAs是一類長20～25個核苷酸的具有調控功能的非編碼RNA，在T2DM在內的多種代謝疾病的發生發展中具有重要作用，可能作為臨床應用。而對于T2DM的研究，組織特別是胰腺組織的標本難以獲得，但miRNAs能夠在外周血中穩定檢測到，稱為循環miRNAs，對于T2DM的研究具有更為顯著的意義〔3〕。研究表明〔4〕，miRNA-29在DM鼠的肝臟和胰腺組織中高表達，可能作為診斷標志物之一，推測為DM的候選基因之一，且其通路與翼螺旋轉錄因子(FOXA)2密切相關。但miRNA-29在DM發生發展中的具體機制仍待進一步探索，本研究探討循環miRNA-29水平與胰島素抵抗(IR)的相關性。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2014年3月至2015年9月武漢市普仁醫院內分泌門診查體或就診的患者作為研究對象，納入標準：①自愿參加該項研究并能配合隨訪；②均接受口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)：采用2 h，75 g葡萄糖的OGTT試驗，患者在空腹口服糖后2 h采集肘靜脈血液，檢測血漿葡萄糖(PG)含量；③糖耐量評價標準：糖耐量正常為空腹血糖(FPG)<5.6 mmol/L并且餐后2 h血糖(2 h PG)<7.8 mmol/L；空腹血糖受損(IFG)為FPG 5.6～6.9 mmol/L且2 d h PG<7.8 mmol/L；糖耐量減低(IGT)為FPG<5.6 mmol/L且2 h PG7.8～11.0 mmol/L；IFG+IGT為FPG 5.6～6.9 mmol/L且2 h PG 7.8～11.0 mmol/L，初發DM(n-DM)為FPG≥7.0 mmol/L和(或)2 h PG≥11.1 mmol/L。④排除有惡性腫瘤、心腦血管疾病或可能影響miRNA表達的慢性病等患者。本研究經本單位醫學倫理委員會批準，且所有受試者簽署針對研究的知情同意書。研究分組：將所有納入對象按照糖耐量試驗結果及評價標準分為：糖耐量正常(NGT)組56例，DM前期(pre-DM)組51例和n-DM組58例。

1.2一般資料檢測 測量3組受檢者的身高、體重、腰圍和臀圍，計算體重指數(BMI)、腰臀比。在清晨空腹狀態下測量血壓，連續測量2次，取其平均值，并抽取靜脈血，送檢驗科，檢測FPG(氧化酶法，日立7600-020全自動生化分析儀)，檢測血脂包括總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)(酶法，美國雅培AR-CHTECT C800全自動生化分析儀)，檢測糖化血紅蛋白(HbA1c，HLC-723G7全自動HbA1c分析儀)，檢測空腹胰島素(FINS，化學發光法)。胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5；ISI=1/(FPG×FINS)。

1.3血清miRNA-29及FOXA2 mRNA檢測 所用試劑和儀器：Trizol 試劑由美國Invitrogen公司提供，TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒、miR29、FOXA2 mRNA和U6 TaqMan檢測試劑盒(美國Applied Biosystems)。Liofectamine2000(Invitrogen)氯仿、異丙醇和無水乙醇等常規化學試劑為分析純產品。所有受試者清晨空腹抽取10 ml全血，1 200 r/min離心血清，保存于-80℃冰箱待下一步檢測。Trizol法提取血液中總RNA，嚴格按說明書操作，用TaqMan法進行miR29、FOXA2 mRNA和U6的實時定量PCR檢測。PCR反應在Tpersonal PCR儀上進行。

1.4統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行方差分析t檢驗。相關性采用簡單線性相關分析或者偏相關分析，多因素采用多元逐步回歸分析。

2 結 果

2.1臨床基本指標特征 3組受檢者的BMI、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR、ISI、FPG、FINS和HbA1c比較，差異均有統計學意義(P<0.01)，且這些指標水平在NGT組、pre-DM組和n-DM組中逐漸增加，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2miRNA-29和FOXA2 mRNA的檢測比較 miRNA-29在NGT組、pre-DM組及n-DM組中的相對表達逐漸增加，組間差異有統計學意義(P<0.05)；n-DM組血清FOXA2 mRNA明顯高于pre-DM組和NGT組，pre-DM組血清FOXA2 mRNA明顯高于NGT組(P<0.05)。見表1。

表1 各組受檢者臨床特征比較

與NGT組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與pre-DM組比較：3)P<0.05

2.3血清miRNA-29與各代謝指標的相關性 在DM人群(n=58)中評估miRNA-29水平與各代謝指標變量之間的關系。結果顯示，在DM人群中，血清miRNA-29水平與FOXA2 mRNA、BMI、FINS、TG、FPG和HOMA-IR呈正相關(r=0.553，0.401，0.239，0.420，0.202，0.445，均P<0.05)，與HDL-C和ISI呈負相關性(r=-0.424，-0.354，均P<0.05)，而與年齡和收縮壓無相關性(r=0.106，0.098，均P>0.05)。

2.4影響HOMA-IR的多元逐步回歸分析 在納入受檢者總隊列(n=165)人群中，以HOMA-IR為因變量，血清miRNA-29、FOXA2 mRNA、BMI、TG、TC、HDL-C、LDL-C和HbA1c為自變量，進行多元逐步回歸分析。結果顯示，影響HOMA-IR的獨立危險因素為miRNA-29、FOXA2、BMI和TG(均P<0.05)。見表2。

表2 HOMA-IR水平的多元逐步回歸分析

3 討 論

肝臟作為胰島素作用的靶器官，在維持體內葡萄糖水平和IR等方面具有重要作用。肝臟可以分泌多種與IR及T2DM發生發展的相關蛋白，如默調節蛋白(SIRT)1〔5〕、線粒體脫耦連蛋白(UCP)2表達〔6〕、fetuin-A〔7〕和血管生成素樣蛋白等〔8〕。miRNA是一類與代謝疾病密切相關的微小RNA，已知的與DM及IR相關的miRNA有miRNA-10、miRNA-107和miR-802等〔9～11〕。例如miRNA-29能干擾骨組織中的成骨作用與脂肪化的平衡，最終通過Runx2的脫乙酰化緩解糖皮質激素引起的骨質疏松〔12〕。敲除miRNA-29后，DM鼠的HHDAC4蛋白信號通路被抑制，Nephrin蛋白泛素化，從而增加腎臟足突細胞的紊亂〔13〕。

miRNA-29也與DM發生密切相關，在IR中的作用備受關注，在一些有關IR或DM動物模型中已經得到證實。miRNA-29在糖耐量異常和DM模型鼠的肝臟中表達明顯增加，而胰島素增敏劑使得血清miRNA-29水平回歸正常〔14〕。

本研究表明，初診DM患者血清miRNA-29和FOXA2高于糖耐量異常的人群，糖耐量異常又高于糖耐量正常的易感人群，而此三者人群的HOMA-IR逐漸增大，血糖水平也逐漸上升，推測隨著糖耐量異常的程度及HOMA-IR的增加，血清miRNA-29和FOXA2的水平逐漸增加。本研究顯示miRNA-29能通過FOXA2途徑影響HOMA-IR〔4〕，而且，多元回歸分析顯示，血清miRNA-29水平是IR和胰島素敏感的獨立影響因素。動物模型研究表明〔15，16〕，miRNA-29參與肝臟細胞轉錄后調節劑信號轉導途徑，可能是參與IR水平的重要途徑。miRNA-29a首先通過3′UTR區域結合PI3K的亞基p85α，該亞基也是蛋白激酶Akt的上游調節介質，而Akt能通過抑制PEPCK蛋白的表達影響胰島素的水平。研究顯示miRNA-29可能是通過FOXA2途徑調節Akt的磷酸化過程，從而影響HOMA-IR〔4，15〕。

本研究也發現，在DM人群中血清miRNA-29水平不僅較易感人群高，而且miRNA-29與BMI、腰臀比和TG呈正相關，說明TG、FPG與IR的關鍵因素肥胖和BMI密切相關，研究表明〔17〕，miRNA-29在脂肪細胞中能影響胰島素刺激的Akt磷酸化過程，故推測隨著BMI的升高，腹內脂肪面積增加，導致血清游離脂肪酸和TG水平上升，影響了Akt磷酸化過程，從而發生IR。此外，本研究提示FOXA2與miRNA-29呈正相關，即FOXA2隨miRNA-29的增加而上調，且FOXA2也是IR的獨立危險因素。FOXA2是已經被確認的胰島素敏感性轉錄調節因子，參與糖和脂質代謝調節的基因表達〔18〕。研究表明〔19〕，野生型小鼠血漿胰島素通過核排斥可以抑制FOXA2，而在IR的小鼠中FOXA2持續定位于肝臟細胞中，FOXA2還可以介導Akt的去磷酸化增加肝臟TG的含量，降低肝臟胰島細胞的敏感性，導致血糖紊亂。而抑制FOXA2磷酸化的藥物能促進機體能量消耗，改善血糖，可能達到治療T2DM或代謝綜合征的效果。

本研究也存在很多不足，例如對HOMA-IR指數的評估未能采取金標準-葡萄糖鉗夾法，而是采用基礎狀態的指數-HOMA-IR和ISI，而且，本研究是一個小樣本的橫斷面研究，只能從相關性的角度去探討，無法完全確認miRNA-29是直接導致IR的危險因素，還是在發生IR或糖耐量異常時代償性升高，還需要大樣本研究及相關基礎研究進一步闡明。

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