CD4+CD154+T細胞亞群在中老年侵襲性真菌感染患者診斷中的應用價值

丘金浪 李玉花 黃小燕 高乾瑜 林 榮 林 虹

(福州市中醫院檢驗科，福建 福州 350001)

侵襲性真菌感染(IFI)早期癥狀和體征缺乏特異性，因此診斷往往十分困難，若未經治療死亡率可高達100%〔1〕。在IFI的早期診斷中，使用常規的檢查方法其鏡檢的陽性率都偏低，因此，往往利用真菌培養的方式以提高病原菌檢出的陽性率，但真菌培養敏感性低且耗時長，對早期的診斷也存在一定的缺陷〔2〕。近年來，包括降鈣素原(PCT)檢測、C-反應蛋白(CRP)檢測、半乳甘露聚糖試驗(GM試驗)、(1，3)-β-D葡聚糖實驗(G實驗)和熒光定量PCR等快速診斷方法迅速發展，已逐漸應用于IFI的臨床診斷。但是，以上方法均存在一定的局限性〔3〕。近期Bacher等〔4〕研究發現真菌特異性CD4+CD154+T 細胞檢測可快速診斷IFI。本研究旨在評價CD4+CD154+T細胞診斷在中老年IFI患者的價值。

1 材料和方法

1.1研究對象 選取2015年5月至2017年1月在福州市中醫院呼吸科、重癥醫學科就診并確診為IFI的中老年患者共20例為IFI組，IFI的診斷標準參照《侵襲性肺部真菌感染的診斷標準與治療原則(草案)》〔5〕。納入標準：均符合IFI診斷標準，并由主治醫生確診為IFI的中老年患者。排除標準：(1)正在血液透析患者；(2)使用某些如多粘菌素E、厄他培南、頭孢噻肟和磺胺類藥物的患者；(3)食用香菇多糖的患者；(4)哺乳期或孕期婦女；(5)合并真菌和細菌感染患者。細菌感染但無真菌感染患者納入細菌組20例；既無真菌感染，也無細菌感染者納入健康組20例。其中IFI組患者年齡45～99歲，平均(68.6±17.7)歲；細菌組年齡46～94歲，平均(73.30±17.78)歲；正常組年齡46～96歲，平均(70.90±16.94)歲。各組男女比例均為1∶1。各組間年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與設備 流式細胞儀BD Accuri C6購自美國BD公司；血常規分析儀XN-1000購自日本希森美康公司；MB-80微生物快速動態檢測系統購自北京金山川科技發展有限公司；艾瑞德快速免疫分析儀為日本株式會社常光公司產品；梅里埃BACT/ALERT3D60全自動血培養分析儀。

1.3試劑 PE-anti CD154、APC-Cy7-anti CD4、FITC-anti CD3熒光抗體均購自Biolgend 公司；真菌BG檢測采用GKT-5M動態真菌檢測試劑盒(光度法)，購于北京金山川科技發展有限公司；PCT檢測試劑盒和CRP檢測試劑盒均購于日本株式會社常光公司；XN-1000血常規分析儀檢測試劑購于日本希森美康公司；血培養瓶購于梅里埃公司。

1.4檢測方法

1.4.1血常規檢測 采集患者靜脈全血，按照希森美康XN1000儀器操作說明進行操作檢測。WBC參考值：(5～10)×109/L。

1.4.2血清(1，3)-β-D葡聚糖檢測 采用無熱源BD專用采血管采集患者外周靜脈血。3 000 r/min離心10～15 min，靜置，取上清液待檢。采用北京金山川科技發展有限公司生產的GKT-1M真菌及配套的T01智能恒溫儀、水浴槽。嚴格按照試劑盒說明書進行檢測操作。判斷標準：0～60 pg/ml陰性；61～100 pg/ml灰區；≥100 pg/ml 陽性。

1.4.3CRP和PCT檢測 分別采集患者靜脈全血，按照艾瑞德快速免疫分析儀操作說明進行操作檢測。CRP參考值0～10 ng/ml，PCT參考值0～0.5 ng/ml。

1.4.4CD4+CD154+T細胞檢測 采集患者靜脈血，EDTA-2K抗凝，以PE-anti CD154、APC-Cy7-anti CD4、FITC-anti CD3熒光抗體孵育30 min，流式細胞檢測CD4+CD154+T細胞水平。

1.5觀察指標 觀察三組CD4+CD154+T細胞水平、(1，3)-β-D葡聚糖水平、CRP水平、PCT水平和WBC水平，并用ROC曲線和曲線下面積(AUC)分析CD4+CD154+T細胞亞群診斷IFI的敏感性和特異性。

2 結 果

2.1IFI組、細菌組和健康組各指標比較 三組之間WBC水平比較：細菌組>IFI組>健康組，兩兩之間差異均具有統計學意義(P<0.05)。PCT水平比較：細菌組>IFI組和健康組，IFI組與健康組之間差異無統計學意義(P>0.05)；細菌組與其余兩組之間差異均具有統計學意義(P<0.05)。CRP水平比較：IFI組和細菌組>健康組，IFI組與細菌組之間差異無統計學意義(P>0.05)，健康組與其余兩組之間差異均具有統計學意義(P<0.05)。(1，3)-β-D葡聚糖水平比較：IFI組>細菌組和健康組，IFI組與其余兩組之間差異均具有統計學意義(P<0.05)，細菌組和健康組之間差異無統計學意義(P>0.05)。CD4+CD154+T細胞水平比較：IFI組>細菌組和健康組，IFI組與其余兩組之間差異均具有統計學意義(P<0.05)，細菌組和健康組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 IFI組、細菌組和健康組各指標比較

與細菌組比較：1)P<0.05；與正常組比較：2)P<0.05

2.2受試者工作特征(ROC)曲線評估各指標診斷IFI 對IFI組、細菌組和健康組WBC、PCT、CRP、(1，3)-β-D葡聚糖和CD4+CD154+T細胞等指標進行ROC曲線分析結果，見表2。ROC曲線見圖1。通過ROC曲線分析顯示(1，3)-β-D葡聚糖檢測真菌感染時診斷效能最高，AUC為0.980，在所有檢測方法中最大，敏感性及特異性分別為95.00%和93.00%，而CD4+CD154+T細胞次之，AUC為0.837，敏感性及特異性分別為81.00%和82.00%。

表2 各項指標 ROC曲線比較分析

圖1 各項指標ROC曲線

3 討 論

IFI是指真菌在人體組織、血液中生長繁殖，從而引起其器官功能障礙、組織損害及炎癥反應等病理生理發生改變的過程〔6〕。近年來，隨著大劑量廣譜抗生素的應用、骨髓器官移植的開展、抗腫瘤藥物和糖皮質激素及免疫抑制劑的應用，導致像念珠菌血癥和系統性曲霉病等深部真菌感染的發病率和病死率呈明顯上升趨勢〔7〕。IFI主要包括ICU真菌感染、器官移植真菌感染、獲得性免疫缺陷綜合征真菌感染，據統計，三者發病率分別為8%～15%、20%～40%、90%〔8，9〕。引起IFI的病原體可分為兩類：一類為真菌致病菌，另一類為細菌致病菌，真菌致病菌主要包括組織胞質菌和球孢子菌，可在正常宿主和免疫功能低下患者中引起疾病；細菌致病菌主要包括念珠菌和曲霉，一般多侵犯免疫功能受損的宿主〔10〕。IFI快速診斷是降低真菌感染病死率的有效途徑〔11〕。由于IFI診斷缺乏特異性，臨床上對其的檢測無靈敏、簡單的方法，因此一般容易造成誤診、漏診。近年來，PCT、CRP、GM試驗、G實驗和熒光定量PCR等均被用于IFI的快速診斷，但均存在一定的缺陷。PCT屬于非類固醇抗炎物質，多產生于細菌感染，其可作為診斷細菌感染與病毒感染的一項敏感性指標，也常用于預警膿毒癥、系統性炎癥反應綜合征等疾病〔12〕。CRP是重要的免疫反應因子，其一般在感染或其他炎癥過程中由肝臟合成。但是，PCT和CRP檢測均只能診斷細菌性感染，無法辨別是否為真菌感染。(1，3)-β-D葡聚糖是真菌細胞壁的組成成分，其廣泛分布于曲霉菌、組織胞質菌、念珠菌等的細胞壁中。(1，3)-β-D葡聚糖在淺部真菌感染時不會被釋放，因此，GM試驗可用于輔助診斷深部真菌感染；GM試驗也是當前已經確證用于檢測曲霉菌的方法，但其檢測結果往往易受某些食物或藥物的影響。G試驗屬于廣譜的真菌檢查，具有簡單、快速的優點，但其無法區分真菌種類，在污染、血液透析、使用某些如多粘菌素E、厄他培南、頭孢噻肟和磺胺類藥物或者食用香菇多糖的患者均可出現假陽性結果，因此一般需與其他檢測方法聯合使用〔13〕。

實時熒光定量PCR檢測對患者創傷小，而且取材方便，其可檢測出組織中真菌的脫氧核苷酸，并可以定量檢測有無真菌感染以及種屬，但是耗時長且成本較高。CD4+CD154+T細胞是機體抗感染過程中免疫反應的重要活化細胞，當機體受到細菌感染是，細胞中CD4+CD154+T的表達會發生變化，其通過對機體非特異性B細胞進行活化引起一系列免疫應答反應。本研究結果也表明其在IFI患者中表達水平也是存在明顯差異，因此可作為診斷IFI的指標〔14〕。由于本實驗過程中嚴格按照G試驗檢測要求，避免了患者在檢測過程中受到各干擾因素影響，因此在研究中(1，3)-β-D葡聚糖水平檢測的準確性才能達到較理想的水平，實際檢測過程中(1，3)-β-D葡聚糖水平檢測往往容易受到各種干擾因素影響從而降低檢測的準確性。CD4+CD154+T細胞在診斷IFI的敏感性和特異性分別為81.00%和82.00%，說明CD4+CD154+T細胞對中老年IFI患者的診斷相比其他常用方法具有一定的優勢，可作為有效的檢測方法之一。

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