雷帕霉素對氧化應激引起脊髓損傷的作用及機制

宋 宇 劉冬麗 趙金武 陳 慧 劉佳梅

(長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031)

脊髓損傷是一種臨床上常見的、不可恢復性的、致殘性的中樞神經系統疾病，目前尚無有效治療方法〔1〕。脊髓損傷的病理機制與活性氧簇(ROS)的產生緊密相關，ROS通過破壞細胞膜、氧化細胞的蛋白質和DNA殺傷細胞〔2〕，氧化應激損傷被認為是脊髓二次損傷的病理特點。ROS的體內代謝種類繁多，過氧化氫(H2O2)是其中一種，由于其化學性質穩定，成為氧化應激細胞模型中最常用的藥物。我們利用H2O2作用PC12細胞成功建立氧化應激損傷模型，復制脊髓損傷后神經元的二次損傷病理過程。雷帕霉素(Rap)是成熟的藥物，有文獻報道其在中樞神經系統疾病中，它抑制mTOR信號通路，通過上調自噬水平、抵抗凋亡途徑，起到神經保護作用〔3，4〕；目前在脊髓損傷疾病中作用尚不明確。本文研究Rap對氧化應激引起脊髓損傷的作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗試劑及細胞 DMEM培養基購于Gibco公司；胎牛血清(FBS)購于Gibco公司；馬血清購于Hyclone公司；Hoechst33342染色劑購于江蘇碧云天生物有限公司；兔抗大鼠LC3-Ⅱ多克隆抗體購于Abcam公司；Rap(553211) 購于Merck公司；MDC(D4008)購于美國Sigma公司；DCFH-DA(D6883)購于美國Sigma公司。上海細胞庫購買PC12細胞。

1.2實驗方法

1.2.1PC12細胞的培養 利用5%馬血清和10%FBS加鏈霉素 100 mg/L、青霉素 100 U/L的DMEM培養液調制成PC12細胞的培養液。5%CO2的細胞培養箱37℃培養，隔2 d細胞換液，隔4 d細胞分瓶。

1.2.2氧化應激損傷模型的建立 在37℃、5%CO2條件下，將PC12細胞在胰酶處理后接種于96孔板，密度是每孔5×103，10% FBS的高糖DMEM培養達到每孔80%的密度。加H2O2引起PC12細胞的氧化應激損傷，應用MTT法檢測不同濃度H2O2作用不同時間的細胞存活率變化，獲得有效作用濃度。取H2O2100，200，400和800 μmol/L的不同濃度，作用12 h和24 h后觀察實驗結果。

1.2.3Rap作用PC12細胞活力的測定 在37℃、5%CO2條件下，將PC12細胞在胰酶處理后接種于96孔板，每孔200 μl，密度是每孔5×103，培養至PC12細胞完全貼壁后進行分組：PC12組(正常組)；PC12+H2O2組(損傷組)；PC12+ H2O2+Rap組(Rap組)。預先用Rap作用PC12細胞30 min和2 h，然后加H2O2作用PC12細胞24 h，最后用MTT法檢測細胞活力的變化。檢測Rap預作用后，不同時間點PC12細胞氧化損傷的變化。

1.2.4MTT法檢測 100 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中溶解0.5 g MTT，4℃避光存放。單孔滴加20 μl MTT，培養3 h。波長570 nm處酶標儀讀取OD數值。獲得數據后，匯總統計，比較各孔細胞活力。

1.2.5MDC法染色 將1.2.3中各組細胞去除培養基，清洗3次；MDC溶于DMSO配成50 μmol/L濃度，單孔滴加200 μl，共育10 min；清洗3次，10%多聚甲醛固定30 min，清洗3次，封片劑防淬滅制片；355 nm波長熒光顯微鏡觀察，熒光顆粒代表細胞內自噬泡。在各組細胞內隨機選取5個視野拍照統計。

1.2.6Western印跡檢測自噬相關蛋白的變化 PC12細胞懸液接種于6孔板，密度是每孔5×105，按1.2.3實驗步驟分組，并制備H2O2損傷模型；Rap預先處理細胞，然后提取各組細胞內蛋白；自噬相關抗體LC3-Ⅱ(1∶500)作為一抗檢測蛋白，用Quantity one軟件分析LC3-Ⅱ表達。

1.2.7ROS生成的檢測 使用無血清培養液將DCFH-DA熒光染料稀釋至10 μmol/L，檢測細胞內ROS的變化。按1.2.3實驗步驟分組；每孔加入DCFH-DA 200 μl，共育60 min；無血清細胞培養液洗滌3次；488 nm激發波長下，檢測DCF熒光強度，鏡下選取合適視野拍照；利用Image J軟件對熒光圖片進行光密度檢測，分析匯總各組熒光強度間接反映PC12細胞活性氧變化。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1H2O2作用PC12細胞活力改變 100，200，400和800 μmol/L的H2O2與PC12 細胞分別作用12 h和24 h，H2O2濃度是100 μmol/L時細胞活力沒有明顯變化；當H2O2濃度是200 μmol/L時，作用12 h細胞活力下降，作用24 h細胞活力下降更加明顯；當H2O2濃度是400 μmol/L時，作用12 h和24 h細胞活力下降差異無統計學意義(P>0.05)；當H2O2濃度是800 μmol/L時，作用12 h與400 μmol/L濃度時細胞活力差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。綜合分析，選取H2O2的濃度是200 μmol/L、作用時間是24 h作為細胞氧化應激損傷的前提條件，建成細胞損傷模型。

2.2Rap預處理PC12細胞活力的變化 損傷組與正常組比較，細胞存活率為71%，差異有統計學意義(P<0.01)；Rap組與損傷組比較，Rap預先處理30 min細胞存活率是72%，預先處理2 h細胞存活率是81%；Rap預處理30 min細胞活力與PC12+H2O2組接近，差異無統計學意義(P>0.05)；Rap預處理2 h細胞活力有明顯改善，與PC12+H2O2組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。Rap預處理2 h作為有效的細胞作用時間。

2.33組細胞內MDC染色觀察 正常組細胞內自噬泡顆粒數量較少；損傷組細胞自噬泡顆粒數量較多；Rap組細胞自噬泡顆粒數量明顯增多，細胞內的熒光強度明顯增強，Rap明顯增加了細胞內的自噬活性，見圖1。

表1 不同濃度、時間H2O2對PC12細胞活力的變化

與正常組比較：1)P<0.01

表2 Rap預處理PC12細胞活力的變化

與正常組比較：1)P<0.01；與損傷組比較：2)P<0.05

圖1 各組細胞內MDC的染色觀察(×400)

2.4Western印跡法觀察各組細胞內LC3-Ⅱ的變化 與正常組(1.00±0.00)比較，損傷組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達(1.57±0.02)明顯增加(P<0.01)，提示氧化損傷時細胞自噬活性增強，Rap組與損傷組比較LC3-Ⅱ高表達(2.21±0.05)，證實Rap預處理后，細胞自噬途徑上調更加明顯，強于氧化應激損傷時的自噬活性，見圖2。

2.5各組細胞內ROS的變化 正常組ROS的含量較低，提示正常細胞內只有少量的活性氧代謝，損傷組(1.00±0.12)與正常組(8.98±0.78)比較，ROS的平均熒光強度明顯增強(P<0.01)。Rap組(3.26±0.54)與損傷組比較，ROS的平均熒光強度明顯減少(P<0.01)，ROS含量明顯減少。提示氧化應激損傷時ROS的生成最多，Rap預處理后可以減少ROS的產生，見圖3。

圖2 各組細胞內LC3-Ⅱ的表達變化

圖3 各組細胞內ROS的變化(×200)

3 討 論

本文MTT結果證實Rap具有細胞保護作用，這與前期大鼠脊髓損傷的動物模型結果相一致〔5〕。細胞內自噬泡形成過程中，先形成LC3-Ⅰ，后酶解成LC3-Ⅱ，最后在自噬體膜上結合形成自噬體，本文結果證實，細胞在氧化應激狀態下，自噬活性上調，Rap起到了自噬激活劑的作用。本文部分實驗結果與中樞神經系統損傷〔6，7〕、脊髓損傷的文獻報道相一致〔8〕。在細胞自噬研究中，有文獻報道線粒體位置與ROS染色區域高度重疊〔9〕，也有文獻證實ROS大量產生于線粒體〔10〕。當細胞發生氧化應激反應時線粒體會有大量損傷，雖然此時自噬活性上調，但也不能吞噬損傷的全部線粒體，部分損傷的線粒體會排放出大量的ROS，后者則通過破壞細胞膜、氧化細胞的蛋白質和DNA殺傷細胞。本文結果證實，H2O2損傷組PC12細胞，ROS大量產生，發生氧化應激損傷，認為這是細胞死亡的主要原因。Rap使ROS水平下調，減小了氧化應激損傷。有文獻報道，細胞通過自噬活動吞噬受損的線粒體，清除細胞內的活性氧〔11〕。據此推算，Rap通過上調自噬活性，增強了清除受損線粒體的能力，繼而減少線粒體破壞后ROS的釋放，減少細胞內毒性物質的釋放，提高了細胞存活率。

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2Oka T，Hikoso S，Yamaguchi O，etal.Mitochondrial DNA that escapes from autophagy causes inflammation and heart failure〔J〕.Nature，2012；485(7397)：251-5.

3Ravikumar B，Vacher C，Berger Z，etal.Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease〔J〕.Nat Genet，2004；36(6)：585-95.

4Webb JL，Ravikumar B，Atkins J，etal.α-Synuclein is degraded by both autophagy and the proteasome〔J〕.J Biol Chem，2003；278(27)：25009-13.

5Song Y，Xue H，Liu TT，etal.Rapamycin plays a neuroprotective effect after spinal cord injury via anti-inflammatory effects〔J〕.J Biochem Molec Toxicol，2015；29(1)：29-34.

6Carloni S，Buonocore G，Balduini W.Protective role of autophagy in neonatal hypoxia-ischemia induced brain injury〔J〕.Neurobiol Dis，2008；32(3)：329-39.

7Yan WJ，Zhang HP，Bai XG，etal.Autophagy activation is involved in neuroprotection induced by hyperbaric oxygen preconditioning against focal cerebral ischemia in rats〔J〕.Brain Res，2011；1402(7)：109-21.

8Tanabe F，Yone K，Kawabata N，etal.Accumulation of p62 in degenerated spinal cord under chronic mechanical compression〔J〕.Autophagy，2011；7(12)：1462-71.

9Scherz-Shouval R，Shvets E，Fass E，etal.Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4〔J〕.EMBO J，2007；26(7)：1749-60.

10Adam-Vizi V，Chinopoulos C.Bioenergetics and the formation of mitochondrial reactive oxygen species〔J〕.Trends Pharmacol Sci，2006；27(12)：639-45.

11Scherz-Shouval R，Elazar Z.ROS，mitochondria and the regulation of autophagy 〔J〕.Trends Cell Biol，2007；17(9)：422-7.