姜黃素對波動性高血糖處理下人臍靜脈內皮細胞DNA氧化損傷的影響

周淑琴 張守法 張 偉 張洪濤

(濟南市第四人民醫院保健科，山東 濟南 250031)

糖尿病可導致多種血管并發癥并且是動脈粥樣硬化發生的重要危險因素〔1〕。血管內皮細胞在維持血管正常結構及功能方面具有重要作用。動脈粥樣硬化多繼發于多種因素所致的內皮細胞功能損傷〔2〕。在這些危險因素中，氧化應激的致動脈粥樣硬化作用已得到廣泛闡釋〔3〕。氧化應激即體內活性氧的產生與消除失衡，可導致人體脂質、蛋白及DNA的氧化損傷。目前已知，DNA氧化損傷可致機體核內遺傳信息的缺損。當機體抗氧化能力不足時，累及的氧化損傷DNA將導致相應細胞功能的喪失。現有的研究表明，DNA的氧化損傷不僅是動脈粥樣硬化的伴隨損傷，而是動脈粥樣硬化發生發展的重要原因〔4〕。糖尿病患者除了慢性持續性高血糖外，波動性高血糖(IHG)是另一常見的異常血糖狀態〔5〕。IHG較持續性高血糖(SHG)更易通過誘導單核細胞黏附至內皮細胞及誘發氧化應激而參與糖尿病血管并發癥的發生發展〔6～8〕。姜黃素是一種具有多種生物活性的中藥材?？寡趸饔檬墙S素發揮藥用作用的重要機制，通過清除氧自由基，改善體內氧化應激狀態〔9〕。本研究觀察濃度姜黃素對IHG狀態下人臍靜脈內皮細胞DNA氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1細胞培養及處理 人臍靜脈內皮細胞購自上海醫學科學院細胞庫。傳代至10～20代的正常人臍靜脈內皮細胞培養于包含11.1 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清pH7.4 RPMI1640培養基，并被置于37℃含5%二氧化碳的培養箱中。實驗中，細胞先用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍，并被分為不同處理組〔10〕：正常對照(11.1 mmol/L葡萄糖)、SHG(25.0 mmol/L葡萄糖)、IHG(11.1與25.0 mmol/L葡萄糖每隔12 h交替培養)及滲透壓對照組，各培養72 h。處理組細胞均保證每日換液一次。在姜黃素保護作用研究中，姜黃素溶于RPMI1640培養基中致終濃度分別為2.5、5.0及10.0 μmol/L。

1.2胞內活性氧的檢測 選用2,7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)作為檢測探針。不同處理組細胞培養72 h后，先沖洗2次，然后置于含10 μmol/L DCFH-DA的培養基中處理30 min。處理后再次沖洗一遍并將細胞收集于PBS中。用流式細胞儀檢測2′,7′-二氯熒光素(DCF)熒光用于計算胞內活性氧濃度。

1.3總抗氧化能力檢測 培養細胞上清液中總抗氧化能力的檢測基于將Fe3+-TPTZ轉化為Fe2+-TPTZ的能力。檢測試劑盒購自南京建成并嚴格按照試劑盒的說明執行。

1.48-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)濃度檢測 采用酶聯免疫吸附(ELISA)法完成，試劑盒購自美國OXIS公司。首先應用DNA提取試劑盒提取人臍靜脈內皮細胞DNA，并用酶標儀在OD260 nm/OD280 nm定量DNA量。每200 μg DNA溶于50 μl反應混合液中，并在室溫下用1 μl DNase Ⅰ消化10 min。消化后的樣本置于已包被8-OHdG抗體的檢測孔中，于OD450 nm處檢測吸光度。

1.5單細胞凝膠電泳 即彗星實驗。不同處理后的人臍靜脈內皮細胞懸浮于瓊脂糖溶液并平鋪于玻片上成單細胞層，隨后置于4℃冰箱5 min。玻片隨后置于預冷的裂解液中去除細胞蛋白，僅留核酸部分。裂解過后，放玻片至電泳槽，置于新鮮電泳液于48℃共20 min。取出玻片，用水沖洗晾干并用EB標記。用熒光顯微鏡觀察拖尾情況。每一標本均選3個不同玻片，每一玻片至少隨機計數100個細胞。無拖尾細胞即無DNA氧化損傷細胞。每個玻片均由2個不同人員獨立計數，取兩者平均值計數彗星率〔11〕。

1.6統計學處理 采用SPSS12.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1細胞內活性氧的含量變化 與正常培養狀態的細胞相比，SHG培養細胞胞內活性氧水平升高約160%，而IHG處理細胞具有更高的活性氧水平(P<0.01)。姜黃素可劑量依賴性減輕IHG所致內皮細胞胞內活性氧的水平(P<0.01)，見表1，表2。

2.2內皮細胞DNA氧化損傷 高血糖處理細胞內具有更高水平的8-OHdG水平，且在IHG處理組更明顯(P<0.01)。姜黃素可劑量依賴性地減輕IHG所致內皮細胞胞內8-OHdG的水平(P<0.01)。類似的結果同樣發現于彗星實驗：與正常培養細胞相比，SHG與IHG培養細胞分別具有約2.0倍與3.1倍高的DNA氧化損傷(P<0.01)，而姜黃素可顯著減輕上述病理損傷(P<0.01)，見表1，表2。

2.3胞內總抗氧化能力的含量變化 與正常培養細胞相比，高血糖培養細胞具有較低的總抗氧化能力，且IHG組更明顯(P<0.01)。而姜黃素可劑量依賴性地改善IHG所致內皮細胞總抗氧化能力的降低(P<0.01)，見表1，表2。

表1 IHG加重人臍靜脈內皮細胞氧化損傷

與正常對照組：1)P< 0.01，下表同

表2 姜黃素劑量依賴性的減輕IHG所致人臍靜脈內皮細胞氧化損傷

3 討 論

本實驗發現IHG較SHG更易導致內皮細胞DNA氧化損傷及抗氧化功能失調。同時，姜黃素可劑量依賴性地改善高血糖所致內皮細胞DNA氧化損傷?；钚匝醍a生于氧代謝過程，是血管發育不同階段中一種重要的調節因子〔12〕。然而，氧化與抗氧化的失衡將導致體內氧化應激的產生。在氧化應激狀態下，胞內重要的生物分子包括脂質、蛋白及DNA等均會出現損傷并進而參與許多病理損傷的發生〔13〕。比如，持續過量的活性氧產生及DNA氧化損傷的積累被認為參與動脈粥樣硬化的發生與發展〔4〕。

通常，糖尿病患者內皮功能失調被更多關注于SHG的毒性作用。在正常人體中，血糖被嚴格控制在一個較窄的范圍內。然而，糖尿病患者由于自身調節血糖能力的不足，血糖水平通常在1 d內表現為較大幅度的變化，而這種變化通常伴隨氧化應激的產生〔5〕。目前已有部分研究發現SHG更易誘導內皮細胞凋亡，并上調黏附分子與炎性因子的表達〔6，8，14，15〕。然而，IHG致內皮細胞DNA氧化損傷的潛在毒性作用卻缺乏相關研究。

總抗氧化能力被廣泛用于檢測反映組織細胞氧化應激狀態〔16〕。因而，本研究結果證實IHG可致更嚴重的內皮細胞DNA氧化損傷，且這一毒性作用基于胞內總抗氧化能力的降低。姜黃素具有較強的抗氧化活性〔9〕。本課題組既往的研究發現姜黃素通過其抗氧化作用可減輕缺血再灌注所致兔脊神經的損傷〔17〕。本研究結果證實姜黃素可同時減輕SHG與IHG所致內皮細胞DNA氧化損傷。IHG所致內皮細胞DNA氧化損傷的機制至少部分類似于SHG的毒性作用，且其毒性作用更為明顯。目前，IHG更高毒性作用的具體機制尚不明確。一種可能的解釋是在慢性高血糖狀態下，機體組織細胞逐漸適應并據此調整機體功能以適應這種變化。而IHG將減緩這種自身調節機制進而導致更嚴重的毒性作用〔10〕。

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