微小病變病蛋白尿產生的機制研究進展

嚴瑞紅 盧宏柱

1長江大學第一臨床醫學院兒科（湖北荊州434000）；2公安縣人民醫院兒科（湖北荊州434300）

微小病變病（MCD）是特發性腎病綜合征之一。臨床上以大量蛋白尿，低蛋白血癥，高脂血癥，水腫為主要特征［1?2］。病理上表現為電鏡下可見足細胞足突融合或消失，而沒有其他結構上的改變，也沒有免疫復合物的沉積。血漿蛋白，尤其是白蛋白，怎樣通過腎小球濾過屏障從尿中排出至今仍不十分清楚。近年來，各國研究者對MCD蛋白尿產生的機制進行了大量的研究，本文對此進行綜述。

1 腎小球濾過屏障負電荷減少

1.1內皮細胞表面負電荷分子因為內皮細胞穿孔的大小的原因，常不被看作是阻止蛋白轉送到Bowman氏囊的主要原因。直到后來發現內皮細胞表面覆蓋的足細胞標記蛋白（podocalyxin），一種負電荷蛋白，可以減少穿孔的直徑，推測可能使白蛋白通過內皮細胞運動受阻，但目前還沒有實驗研究來證實這一假說。

1.2腎小球基底膜（GBM）負電荷減少GBM是負電荷存在的主要場所之一。在MCD發展中，GBM的低密度層的負離子場所減少［3］，硫酸類肝素/尿肌酐比值增加［4］。臨床研究還發現用低分子肝素治療小兒原發性腎病綜合征有利于減少蛋白尿，其機制可能是彈性蛋白酶減少了GBM上的葡糖氨基葡聚糖，使GBM上負電荷減少，低分子肝素通過抑制彈性蛋白酶而起作用［5］。因此GBM上的負電荷減少是MCD的原因之一。GOLDBERG等［6］敲除agrin和perlecan基因，使蛋白聚糖缺乏，GBM的負電荷顯著減少，但小鼠不發生蛋白尿，清除分數也無變化。作者認為硫酸類肝素蛋白聚糖可能只有部分表型改變，但不發生MCD。在相似的研究中CHEN等［7］敲除Extl基因，小鼠足細胞表達此基因，足細胞分泌的糖蛋白核心蛋白多聚體受阻，小鼠表現為足突融合，免疫組化分析顯示硫酸類肝素糖蛋白下降，盡管足突融合以及硫酸類肝素的丟失，基因敲除小鼠只表現出輕微的白蛋白尿。VAN DEN HOVEN等［8］用小鼠過表達肝素酶去評估不同硫酸類肝素區域，用抗硫酸類肝素抗體去評估腎臟內不同區域的硫酸類肝素粘多糖相關的陰離子區，發現在轉基因鼠表達呈5倍減少，而腎小球結構和蛋白分泌正常。

1.3導致GBM上負電荷丟失的介質目前發現至少有3種介質在GBM負電荷丟失中起到了關鍵的作用。這3種分子被認為是GBM負電荷丟失的介質：促血管新生蛋白因子樣?4（angiopoietin?4，angptl?4），IL?8 以及血液結合素（hemopexin，Hx）。

人類anglptl?4是分子量在45～65 kD的糖蛋白，被認為是MCD產生蛋白尿的一種介質，在MCD患者的血漿、尿和腎小球中均發現Angptl?4寡聚體220 kD，PI＜ 8，在4個MCD患者中檢出，其中一個人尿中也存在，分子量55～70 kD，PI＞ 8。同樣，angptl?4寡聚體100～600 kD，PI＜ 8和angptl?4分子Pl＞8，在部分MCD患者血中檢測出。血清angptl?4水平在MCD、FSGS 和膜性腎病活動期增高［9］。腎組織免疫熒光顯示弱染色，它位于足細胞、GBM和內皮細胞。Angptl?4在MCD中的可能機制包括足細胞分泌angptl?4（大多數Pl＞8）轉移到GBM和內皮細胞，導致GBM負電荷減少，而出現蛋白尿［10］。在另一組MCD患者中，尿中angptl?4與尿蛋白呈正相關，在MCD復發組較對照組尿中angptl?4增高。這可能是結果而不是腎小球濾過屏障滲漏的原因。的確，尿中angptl?4的水平在其他類型腎小球疾病也增高，如局灶節段性腎小球硬化（FSGS）、膜性腎病等。而且，血清angptl?4水平在MCD的復發期較緩解期及對照組下降，另外，與以前的研究比，MCD復發的腎組織中angptl?4免疫熒光陰性或很弱。最重要的是在人類足細胞培養中加入MCD患者血清，包括復發期和緩解期，足細胞表達angptl?4不增加。最近還沒有發現尿中陽離子型angptl?4（PI＞ 8）。在MCD復發期，發現了PI5.4的angptl?4，因此，挑戰了這一學說。一個高PI的angptl?4是MCD蛋白尿的介質。總之，angptl?4在MCD中的臨床意義還有待進一步確定。

血清IL?8在MCD復發期較緩解期和對照組增高。給大鼠注射IL?8血清水平達到MCD患者相似的濃度，表現出輕度的蛋白尿，用抗IL?8中和抗體可預防蛋白尿，提示IL?8與蛋白尿之間存在因果關系［11］。另外，給大鼠注入IL?8可增加GBM氨基葡聚糖的分解代謝。這些資料提示循環的IL?8在產生蛋白尿的某些作用是通過降低硫酸類肝素蛋白聚糖的合成，從而減少GBM的陰離子電荷，最后導致蛋白尿［12］。

Hx是肝臟合成的一種蛋白質，其受體在肝細胞、神經元和巨噬細胞中均有表達，但至今未發現其受體在腎臟表達。但Hx可以改變腎臟裂孔膜蛋白的信號轉導及neph?rin，podocin，CD2AP蛋白的移位，在各種感染和炎癥急性期均增高，血漿純化和重組的Hx有絲氨酸酶活性，循環的Hx是無活性的，活化的Hx對腎小球濾過屏障有重要的作用，Hx可以使唾液酸糖蛋白和陰離子減少，大鼠實驗發現Hx可以使足細胞足突消失，并出現可逆的蛋白尿［12?13］，從正常人血漿中分離出來一個片段，稱為100 KF片段，分子量為80～100 kD。把它注射到小鼠，15 min后GBM低密度區負電荷減少，尿蛋白分泌增加［14］。筆者認為這一作用是Hx所致。然而，Hx作為MCD的致病因素還缺乏直接證據。

2 足細胞在MCD中的作用

2.1足細胞骨架與裂孔膜的變化MCD是一種足細胞病，腎小球對血漿蛋白通透性的增加是因為足細胞骨架的改變使裂孔膜滲漏，導致蛋白尿。裂孔膜蛋白在維持足細胞骨架穩定中起到了重要作用。足細胞損傷與白蛋白排泄有著密切的聯系［15］。動物實驗表明，敲除podocin基因NPHS2，可以導致蛋白尿，在少量蛋白尿時，電鏡觀察足細胞足突正常，當大量蛋白尿時，出現足突融合或消失［16］。

2.1.1Nephrin在維持足細胞骨架中的作用Nephrin是較早發現的裂孔膜蛋白之一，在維持裂孔膜穩定性中起到重要作用，nephrin丟失多的患者，療效及遠期預后不佳［17］，在眾多的研究中也發現MCD患者足細胞nephrin表達下降，目前只能認為部分MCD可能與nephrin表達下降有關。

Nephrin蛋白的磷酸化是維持足細胞結構與功能的重要因素，是SD與細胞骨架信號轉導中的關鍵調節因子［18］。但用不同方法研究nephrin在MCD中的作用得出了矛盾的結果。一些研究表明腎小球nephrin表達在MCD與正常對照組中無差別。也有證據顯示nephrin mRNA表達下降。這些相互矛盾的結果部分解釋原因可能是使用的研究方法的不同。因此，只能認為MCD nephrin表達下降沒有確切的依據。

Nephrin有調節肌動蛋白聚合的作用。Nephrin磷酸化下降導致蛋白尿，在MCD患者中，nephrin磷酸化py228比正常腎小球下降。與這一研究相同的，在py1217位neph?rin磷酸化在MCD患者腎小球中的表達在蛋白尿期比緩解期下降。把足細胞與MCD復發的患者血清培養和與緩解期血清培養，結果發現前者nephrin磷酸化下降。從形態學上發現肌動蛋白重組也發生改變，基于這些發現，推測足細胞骨架改變破壞了SD的正常形態，導致SD通透性增高，從而出現蛋白尿［19］。Nephrin磷酸化是MCD損傷的機制仍不十分清楚。目前發現3種蛋白可能對nephrin磷酸化過程起到干擾作用，它們分別是CD80、c?mip和SHP?1。

CD80（也稱B7?1）是足細胞表達的一種跨膜蛋白，足細胞CD80與蛋白尿之間的聯系基于一個實驗。注射LPS小鼠足細胞表達CD80增加，足突消失，并出現蛋白尿，相比之下，CD80敲除小鼠注射LPS沒有發現這種現象。內皮素?1 A型受體拮抗劑有抗蛋白尿的作用，這一作用是通過抑制足細胞表達CD80而實現［20］。在MCD患者尿中CD80增高，外周血單個核細胞CD80 mRNA表達增高，而其他腎小球疾病（FSGS、LN）尿中CD80不增高［10，21］。尿中CD80的來源是足細胞，理由是：首先、S?CD80低血清水平（可溶性CD80的分子量是23 kD）復發的MCD患者較正常對照組下降［21］。其次、尿中CD80分子是53 kD，與整個細胞膜相關的CD80一致，與循環的可溶性CD80相反，循環的CD80是B細胞產生的。尿中的CD80與MCD也有密切的關系，并且可以作為判斷MCD對激素治療反應的指標之一［22］。最近研究［10］發現，CD80在7個MCD患者復發期的腎小球中全部存在，但在2個FSGS患者中微量或不存在，在一個MCD患者緩解期也缺失，所有復發期的7個MCD患者小管上皮細胞染色沒有CD80。另一項研究還發現人的足細胞與MCD復發患者血清培養CD80表達增加，并伴隨著nephrin磷酸化減少，而用緩解期患者血清培養沒有這種現象，因此可以認為，CD80可能干擾nephrin磷酸化和抑制Fyn和（或）Nck蛋白。動物實驗還發現TNF?α，polyI：C、LPS和IL?13也刺激足細胞表達CD80，過表達的CD80和Neph1通過細胞外域相互作用，導致裂孔膜破壞［23］。這些結果都支持一個假說，一種循環因子介導蛋白尿。

C?mip是一個86 kD蛋白，Balb/c和SCID小鼠暴露于LPS可以導致蛋白尿和足細胞c?mip過表達，用c?mip siR?NA預處理小鼠再注射LPS，明顯的降低蛋白尿，提示在c?mip和蛋白尿之間有一定的聯系。足細胞c?mip轉基因小鼠足細胞足突消失，大量蛋白尿伴有nephrin磷酸化減少，以及活化的Fyn。用重組的IL?17與小鼠足細胞培養，可導致足細胞凋亡和細胞骨架紊亂，這一作用是IL?17使C?mip過表達，從而下調磷酸化nephrin和Bcl?2水平而起作用［24］。用免疫組化和原位雜交技術在MCD復發期腎小球c?mip較恢復期增高。在Reed?Sternberg細胞和Hodgkins淋巴瘤發展為MCD的患者c?mip選擇性表達，而在Hodgkins患者沒發生蛋白尿時c?mip不表達。最近對1例小細胞型肺癌患者并發腎病綜合征的研究發現，c?mip在足細胞和肺癌細胞中過表達，把患者血清與人足細胞培養，發現足細胞骨架紊亂，并且誘導c?mip表達，說明c?mip在小細胞型肺癌相關的足細胞病中起到重要的作用［24］。體外實驗及動物研究表明足細胞c?mip與Fyn結合阻止他與nephrin作用，導致nephrin磷酸化減少，從而改變下游的連接SD和細胞骨架蛋白信號級聯反應［25］。C?mip在MCD的臨床關聯性還不清楚，因為（1）Fyn缺陷小鼠表現出蛋白尿上調足細胞c?mip、使人想到c?mip是Fyn失調的結果，而不是原因；（2）把人的足細胞與MCD患者復發期血清培養和與緩解期血清培養，Fyn表達無變化，這一發現與假說機制MCD患者c?mip抑制Fyn相矛盾，c?mip可能反映出足細胞對noxa的非特異性效應。

SHP?1屬于PTPs家族，在蛋白酪氨酸激酶如Fyn和PTPs之間的緊密調節，是維持靶蛋白，如nephrin磷酸化穩定水平必須的，反過來調節下游信號通路。在高糖下培養人足細胞過表達SHP?1導致nephrin磷酸化選擇性位點在Tyr1193和Tyr1217殘基，SHP?1抑制防止nephrin磷酸化提示在SHP?1和nephrin之間有聯系［26］。

2.1.2半乳糖凝集素1半乳糖凝集素1（Galectin?1，Gal?1）是一個135個氨基酸組成的蛋白，基因為LSGALS1。是細胞運動、黏附和免疫修飾劑。在人類腎小球內皮細胞和系膜細胞表達，另外，它與nephrin胞外域共存，人類足細胞與重組的Gal?1培養，表現出nephrin磷酸化增加，提示Gal?1在SD中起到了一個信號介導作用，在MCD復發患者的研究中發現腎小球Gal?1表達下降。最近，OSTALSKA等［27］發現在MCD和對照組中均無Gal?1表達，而在FSGS和彌漫性系膜增生患者足細胞中檢測出。

2.1.3血液結合素體外實驗表明Hx通過減少nephrin依賴的細胞骨架改變介導蛋白尿。細胞骨架改變是Hx色氨酸蛋白酶活化的結果，因為當足細胞暴露在Hx低劑量蛋白酶抑制劑AEBSF減少肌動蛋白纖維的重排，這一發現的意義仍不清楚，因為蛋白酶抑制劑SPI具有肌動蛋白重排的獨立作用，用10%正常人血漿預處理，可以完全阻斷Hx對肌動蛋白重排作用。

2.2F?actin與SD蛋白的相互作用Synaptopodin免疫組化研究MCD患者顯示較對照組減弱。但另個研究發現無差異。HORIONUCHI等［28］發現兒童腎病綜合征MCDpodo?cin降低，包括激素耐藥型腎病綜合征。可能與NPHS2突變有關。相反，另一個研究6例MCD用免疫組化的方法，與對照組沒差別［28］。

2.3足細胞與GBM之間的黏附蛋白α?dystroglycane（α?DG）和唾液酸苷酶在MCD和4個正常腎小球中的表達，以及尿中唾液酸兩組無差別。在MCD中，α?DG的表達較正常降低25%～50%因為α?DG免疫金標更強，前者得到的值更確切地反應其病理生理特點。更有趣的是經激素治療的MCD患者α?DG的表達明顯恢復，然而，低表達α?DG的現象不能得出是因為低濃度α?DG而導致的蛋白尿。最近在小鼠發現無α?DG腎小球足細胞足突變平但沒有蛋白尿。

整合素：BARADI等［29］研究整合素家族亞單位用熒光免疫方法，6個正常腎組織和10個MCD、膜性腎病和狼瘡性腎炎，在正常腎小球人a3為主要的整合素熒光呈線性沿GBM分布，在MCD和狼瘡性腎炎a3染色正常。LAH?DENKARI等［30］發現MCD和芬蘭型先天性腎病綜合征伴大量蛋白尿者足細胞與GBM也緊密結合。

3 調節性T細胞（Tregs）與MCD機制之間的關聯

Tregs是一種動態的細胞群體：在平衡狀態下，它們的水平較低。幾乎所有蛋白尿模型都證實了低Tregs和蛋白尿之間有著密切聯系［31］，低Tregs和蛋白尿之間的關系取決于觀察的時間點，動物試驗表明：（1）阿霉素腎病可以通過輸注Foxp3轉導的T細胞或通過輸注腺苷或通過使用低劑量IL?2來調節；在所有這些病例中，循環Tregs上調，蛋白尿下調［32］；（2）將Tregs直接輸入Buffalo/Mna大鼠與蛋白尿減少和腎臟病變消退有關；（3）在LPS腎病中也研究了Tregs的作用，它代表了瞬時蛋白尿的模型；在這種情況下，通過使用IL?2/抗IL?2免疫復合物調節Tregs水平，誘導CD4+細胞分化成 Tregs［33］。輸注IL?2/抗 IL?2可以減少阿霉素腎病大鼠的蛋白尿，改善腎功能。也有相關實驗在用LPS處理的小鼠中，使用相同的方法使得蛋白尿的減少。在用他克莫司治療SRNS的過程中，發現病理類型為MCD患兒，其臨床癥狀完全緩解率要低于MsPGN和FSGS；反而其復發率要高于MsPGN和FSGS［34］。利妥昔單抗與SMP?DL?3b的相互作用可誘導的足細胞肌動蛋白重塑，從而恢復了足細胞的結構和功能［35］。已有很多實驗證明Th17與腎臟疾病的發生有著莫大的聯系，在觀察到低劑量重組IL2是安全的并且可以在人類中使用后，Treg水平的調節已成為MCD的一種新的潛在治療方法。但目前關于Tregs在人MCD中的作用的證據很少，還需進一步研究。

4 結論與展望

MCD蛋白尿的產生是復雜的，內皮細胞及GBM層負電荷的減少可能是原因之一，但目前沒有足夠的證據證明這一點。目前更多的學者認為MCD是一種足細胞病，足細胞nephrin，CD80等蛋白的表達異常在蛋白尿的產生中可能起到了激發作用，動物實驗發現Treg水平也與蛋白尿的產生密切相關，但是導致蛋白尿的確切機制仍不清楚。今后對MCD的研究重點是找出特異性的異常點，以便針對靶點進行特異性的治療，從而取代全身免疫抑制的治療方法。