神經生長因子前體蛋白在糖尿病視網膜神經細胞病變中的作用

周琳琳 楊曉春 梅妍

1昆明理工大學醫學院（昆明 650500）；2云南省第一人民醫院昆明理工大學附屬醫院（昆明650532）；3陰正勤專家工作站（昆明 650032）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病患者的眼部并發癥，是全世界范圍內失明的重要原因之一。隨著全球糖尿病發病率呈指數增長，其DR的患病率也將增加。根據目前的預測，美國糖尿病患者的人數將從2007年的2 780萬人增加到2030年的6 070萬人［1］。目前尚無徹底治療DR的方法，因而這種并發癥發生率的增加，將使患者和醫生面臨一個嚴峻的挑戰，也將給社會和家庭帶來極大的負擔。近年來，有研究發現血清和玻璃體的神經生長因子前體蛋白（pro?nerve growth factor，proNGF）與神經生長因子（nerve growth factor，NGF）比例失衡是DR發生的潛在因素之一［2］。因此，proNGF與糖尿病視網膜病理生理機制的改變密不可分，它對DR的臨床治療具有重要的指導作用。本文以NGF和其前體蛋白及其受體TrkA和p75營養因子受體（p75 Neurotrophin Receptors，p75NTR）在DR的作用予以綜述。

1 DR的神經細胞病變

大量的研究表明DR不僅是一種血管疾病，而且還具有神經退行性成分，視網膜中所有類型的細胞基本上都受到影響，最終導致視覺功能的慢性喪失［3］。DR涉及的視網膜上的神經細胞，包括視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell，RGC）、視錐和視桿細胞、雙極細胞及視網膜神經膠質細胞等，此外還有視網膜外核層明顯變薄，視錐和視桿細胞凋亡［4］。小膠質細胞是負責監測眼睛炎癥反應的主要免疫細胞之一。活化B細胞（nuclear transcription factor?κB，NFκB）和細胞外信號調節激酶（extracellular sig?nal?regulated kinase，ERK）信號通路的核因子κ?輕鏈增強劑介導的活化小膠質細胞中的轉錄變化，導致各種促炎介質（包括細胞因子，趨化因子，半胱天冬酶和谷氨酸鹽）的釋放［5］。在DR中，活化的小膠質細胞遷移并釋放炎性細胞因子，這有助于破壞血液?視網膜屏障，神經元丟失和增強的活性氧產生，導致神經元凋亡增加并隨后使視覺喪失［6］。Müller細胞是視網膜神經膠質細胞，是唯一跨越整個視網膜寬度的細胞類型，與視網膜中的幾乎每種細胞類型都有接觸，因此它們具有獨特的定位功能，可以執行維持視網膜動態平衡所需的各種功能，如介導神經元功能障礙，產生促血管生成因子導致新血管形成，建立慢性炎性視網膜環境和最終誘導細胞死亡［7］，同時它們還表現出成纖維細胞樣表型和在DR中的遷移能力［8］。RGC是晚期分化的中樞神經系統神經元，它們在受傷后具有有限的內源性再生能力，因此RGC死亡會導致永久性的視覺損失［9］。DR早期的視網膜神經細胞病變主要涉及RGC細胞，表現為細胞數量的明顯減少［10］。YANG等［10］在其報道中指出在糖尿病小鼠模型中，糖尿病發病后6和12周，糖尿病小鼠的眼壓水平顯著升高，而且在糖尿病小鼠中發生視網膜神經細胞減少，這說明RGC減少可能是糖尿病視網膜病變的重要組成部分。

2 糖尿病RGC受損的機制

目前研究發現多種機制參與了DR，主要包括如下幾種：（1）Nogo?NgR機制。Nogo受體是神經元凋亡的重要因子，Nogo蛋白受體（NgR）有抑制神經再生的功能，多種致盲性疾病導致RGC凋亡的機制可能與NgR表達上調Caspase?3表達、誘發氧化應激有關［11］。GUO等［12］發現在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型中，糖尿病發病后12周，視網膜nogo受體和Rho激酶表達明顯增加，視網膜神經節細胞凋亡明顯，而用RNA干擾抑制大鼠視網膜Nogo受體的表達，可明顯抑制視網膜Rho激酶的表達，明顯降低糖尿病大鼠視網膜神經節細胞的凋亡。（2）基質金屬蛋白酶?9（matrix metalloproteinase?9，MMP?9）機制。小膠質細胞在DR期間的神經炎癥和病理變化中的有著重要的作用。ZHU等［13］通過用高糖刺激小膠質細胞Bv2細胞模擬糖尿病微環境，研究發現芍藥甙通過上調細胞因子信號傳導3（suppressor of cytokine signaling?3，SOCS3）在糖尿病視網膜病變中抑制TLR4/NF?κB途徑抑制高葡萄糖誘導的視網膜小膠質細胞MMP?9的表達和炎癥反應，此外，DR相關的神經元損傷或血管損傷可通過此通路治療減輕。（3）proNGF及p75NTR途徑。p75NTR是proNGF的高親和力受體，當p75NTR水平較高時，proNGF能介導神經系統的不同損傷，并介導神經細胞的凋亡。IBáN?ARIAS等［14］在其報告中指出新的DHEA環氧衍生物BNN27通過激活NGF的原肌球蛋白相關激酶A（Tropomyosin?related kinase A，TrkA）受體，降低p75NTR的表達和膠質細胞的活化，逆轉糖尿病所致的視網膜損傷。這提示proNGF?p75NTR途徑對保護糖尿病患者的視覺功能具有非常重要的意義。

3 NGF、proNGF生物學特點

NGF是一種廣泛存在于人類組織中的多能介質，它最初被認為僅在神經元動態平衡和病理生理學中是重要的，但是后來的研究發現它也涉及炎癥，上皮分化和傷口愈合的病理生理學［15］。NGF是前腦膽堿能神經元存活和功能維持所必需的，主要分布和產生在大腦皮層和海馬，但成熟的NGF（Mngf）具有存活/分化的作用，其前體能引起膽堿能神經元的凋亡［16］。它除了活躍于廣泛的非神經系統細胞外，還由一系列細胞類型合成，這些細胞類型被認為不是NGF依賴性神經元神經支配的經典靶點，這些細胞包括免疫?造血系統的細胞和腦中參與神經內分泌功能的群體［17］。在視覺系統中，這種神經營養素及其受體TrkA和p75NTR在大多數眼內組織（包括晶狀體、玻璃體、脈絡膜、虹膜和小梁網）中存在，這也突顯了NGF在眼部病變中的重要作用［18］。

proNGF的編碼基因位于第一對染色體的近短臂上，是NGF的前體的形式，經過蛋白水解裂解產生的成熟形式NGF。它能激活2個獨特的受體，分別是原肌球蛋白的酪氨酸激酶受體（tyrosine kinase，TrK）和p75NTR［19］。NGF以成熟形式和前體形式存在。這兩種形式對神經元具有相反的作用：NGF誘導增殖，而proNGF通過結合常見的神經營養因子受體（p75NTR和sortilin）形成復合物誘導細胞凋亡［20］，但它也會發揮神經營養作用。proNGF發揮的這兩種作用，其取決于相應受體水平。當其低親和力受體TrK水平較高時，其主要表現為神經營養活性。然而當高親和力受體p75NTR水平較高時，ProNGF能介導神經系統的不同損傷。一般認為NGF主要通過TrkA發揮作用，誘導酪氨酸激酶啟動的級聯反應，而proNGF與p75NTR結合更強［21］。proNGF對神經系統的正確發育至關重要。

p75NTR是TNF?α受體超家族的成員，它的分布十分廣泛，在施萬細胞、少突膠質細胞及運動神經元等均有表達。p75NTR能與所有NT結合，主要調節其促凋亡作用，且它是眼睛、腦、心臟和周圍肢體的多種缺血性血管疾病的主要參與者，其在這些疾病中表達明顯增加并伴有神經血管損傷［22］。神經營養因子前體蛋白（pro?neurotrophin，proNT）和p75NTR作用后能夠促進細胞凋亡、抑制生長、減弱突觸功能。在細胞受損，比如炎癥、外傷和病變等情況下，P75NTR會表達上調，介導proNGF誘導神經細胞凋亡。proNGF現在被認為是一種生物活性信號分子，在誘導視網膜細胞減少中的作用在神經退化的條件下顯得尤為重要［23］。因此，越來越多的證據支持神經營養因子蛋白在視網膜疾病中的新興作用，特別是在DR中［19］。

4 proNGF與NGF失衡介導糖尿病視網膜神經細胞損傷

糖尿病誘導的氧化應激改變視網膜NGF的穩態，導致其前體proNGF的積累。而其前體是在中樞神經系統中的主要形式，以犧牲NGF為代價，其在保護神經元和視網膜功能中起關鍵作用。而這種不平衡與實驗性DR損傷相吻合。糖尿病所導致的proNGF/NGF的不平衡這一表征進一步提示其可能為糖尿病并發癥的早期標志物［2］。此外，proNGF/NGF的失衡對提示DR的病程不再處于早期有重要意義，其可能預示著視網膜炎癥、神經變性、血管通透性和無細胞毛細血管的發展［19］。TRABJERQ等［20］通過比較NGF和proNGF的成熟部分中的氫/氘交換，發現proNGF的前體部分的存在導致成熟部分中的3個環區域的結構穩定化，其作用可能是通過分子直接相互作用。Trabjerq E使用串聯質譜分析，進一步發現了proNGF的前端中兩個N?連接和兩個O?連接部位出現糖基化。這些結果助于為NGF和proNGF在分子水平上的多種生物效應提供理論依據。越來越多的證據支持proNGF失調與早期視網膜炎癥，神經和微血管變性之間存在著非常密切的聯系［19］。研究還表明，糖尿病引起的神經營養因子失衡在于增加其前體形成，這與在視網膜中上調p75NTR受體相關。MYSONA的研究發現：糖尿病改變了NGF的平衡，NGF的減少，并導致了受體p75NTR的聚集，提示proNGF?p75NTR軸在DR的病理生理機制中具有重要作用［24］。

5 proNGF和p75NTR、sortilin相互作用，直接介導糖尿病視網膜神經細胞損傷

TrkA、TrkB和TrkC是神經營養素的另一類主要受體，兩者結合后具有較強的修復和促存活功能。ProNGF與其各種受體間存在著相互聯系、相互影響，又相互獨立的關系。MEEKER等［25］發現：盡管Trk受體被特定的神經營養因子直接激活，但p75NTR作為一種多功能受體，通過與TrkA，TrkB，TrkC，sortilin或Nogo受體的異二聚體相互作用來發揮其作用，以調節多種細胞功能。P75NTR能通過與不同的配體結合，調節成熟proNGF與受體的結合，激活不同的信號傳導途徑，進而影響細胞的生長、存活及死亡。LOANNOU等［26］系統地改變TrkA受體水平，啟動細胞因子，利用輕微干擾RNA，并利用誘變PC12nnr5細胞系，發現在不存在TrkA的情況下，即使p75NTR和sortilin水平降低，也會發生proNGF誘導的細胞死亡，結果表明proNGF可以響應于TrkA受體水平的變化而在神經營養和凋亡活性之間切換，而成熟的NGF不能。proNGF能夠以高親和力與p75NTR和Sortilin結合，并且啟動神經細胞凋亡程序引起神經元的凋亡、抑制生長、減弱突觸的功能作用。proNGF/p75NTR/Sortilin結合形成的三聚體是誘導神經凋亡的必要條件，其中Sortilin起輔受體及分子開關作用，控制P75NTR，介導ProNGF誘導凋亡前信號。而且，P75NTR與NFκB相互作用可以導致促炎性細胞的激活，因P75ICD可以與蛋白質相互作用在細胞質中或可以改變原子的位置，這有可能直接調控轉錄。p75NTR缺失可使糖尿病引起的視網膜 NGF 表達減弱，而 ProNGF、NFκB、P?nfκB和TNF?α表達增加，同時p75NTR的缺失也能抑制糖尿病誘導的膠質纖維酸性蛋白表達、神經節細胞丟失和血管通透性［24］。因此，控制p75NTR能減弱糖尿病引起的視網膜炎、神經膠質激活缺失，神經節細胞丟失和血管通透性。

6 proNGF介導炎癥，間接誘導糖尿病視網膜神經細胞損傷

炎癥是DR發病的重要因素。DR中出現的神經感覺缺陷與炎癥相關，并且發生在臨床可識別的血管并發癥之前，糖尿病神經缺陷與視網膜神經膠質細胞及神經元對高血糖反應的異常反應有關［27］。p75NTR在成人視網膜中的表達于Müller細胞。在DR中，Müller細胞經歷了激活和膠質化，導致p75NTR和ProNGF的水平升高，它們的自分泌結合促進TNF、α2M等促炎細胞因子的產生和釋放。BAR?CELONE等［28］使用鏈脲佐菌素誘導的小鼠糖尿病模型進行研究，發現糖尿病非常早期p75NTR在神經膠質細胞和周細胞中表達上調，以介導配體依賴性誘導炎癥細胞因子表達，促使神經—神經膠質—血管單元破壞，以及血—視網膜屏障受損，細胞水腫和神經元死亡。在糖尿病誘導早期，白細胞介素?1β（Interleukin?1β，IL?1β）在視網膜的表達增加，并隨著疾病進展而持續增加，這一改變與膠質細胞活化標志物的上調在時間上相關［29］。MOHAMED等［30］用鏈脲佐菌素（STZ）分別誘導野生型和p75NTR基因敲除（p75ko）小鼠糖尿病模型，觀察調節p75NTR對糖尿病視網膜病變的保護作用，數據顯示，糖尿病介導的p75NTR的表達可引起視網膜炎癥，IL?1β和應激激酶JNK表達增加，并表達caspase?3，介導細胞凋亡。而敲除p75NTR則減少了視網膜炎癥和proNGF表達。p75NTR基因缺失抑制了長期糖尿病所致的IL?1β炎癥，可恢復NGF和TrkA的活化。

7 結論

綜上所述，近年來針對DR的診斷和治療方法有一定的進展。自動篩查、光學相干斷層掃描、系統性危險因素控制，以及手術、微脈沖激光和新藥物治療的應用，都豐富了對該疾病的控制手段。然而，這些治療方法并不能取得令人滿意的效果。患者所關注的視功能的維持和恢復，仍是DR治療的重點和難點。而視網膜神經細胞的損傷對患者視覺質量的影響仍是一個非常重要的因素。ProNGF/p75NTR通過直接或間接作用，介導糖尿病視網膜神經細胞損傷的作用已在許多的實驗中得到證實，而其介導損傷的機制正待進一步完全闡明?？梢灶A見，針對ProNGF/p75NTR的干預將有可能是治療和預防DR視網膜神經細胞損傷的新策略，因此在ProNGF/p75NTR的干預科研方面應投入更多的心血和精力。