草魚NADPH氧化酶2個調節亞基cDNA的克隆及表達特征

張 林 ，周劍光，吳 濤

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223；2.武漢輕工業大學，武漢 430023)

NADPH氧化酶主要存在于中性粒細胞及其它吞噬細胞的細胞膜上，能夠產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，具有殺菌作用，并參與宿主細胞的免疫應答[1]。NADPH氧化酶是一種高度調節的多亞基氧化酶復合體[2]，它的組裝與激活需要胞質亞基p47phox、p40phox、p67phox磷酸化與激活，活化的催化亞基p47phox與p40phox轉移到胞膜與胞膜亞基gp91phox及p22phox結合并組裝成NADPH氧化酶全酶。當有適當外源物刺激時，NADPH氧化酶就被轉錄激活。其中胞質亞基p47phox、p40phox在激活NADPH氧化酶中發揮著重要的作用[3-6]。

人(Homosapiens)[7]、鼠(Musmusculus)[8]、野牛(Bisonbison)[9]和海豚(Tursiopstruncatus)[10]NADPH氧化酶的5個亞基均已被克隆和描述。魚類NADPH氧化酶的5個亞基的cDNA也已從紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[11]、鯉(Cyprinuscarpio)[12]、翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)[13]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鮭(Salmosalar)、香魚(Plecoglossusaltivelis)和斑馬魚(Daniorerio)中克隆出來。在NCBI數據庫中僅見到大西洋鮭(Salmo salar)的gp91phox、p47phox、p67phox亞基的cDNA全序列的報道。可見對其他魚類NADPH氧化酶的研究還較少。

草魚(C.idellus)在我國分布廣泛，是非常重要的淡水經濟魚類。然而，疫病是限制草魚養殖業發展的重要因素之一。鑒于NADPH氧化酶能生成用于清除病原微生物的活性氧，在機體的防御體系中起著非常重要的作用，而迄今還未發現有關草魚NADPH氧化酶p47phox、p40phox基因的相關報道。本研究克隆了草魚NADPH氧化酶的2個重要調節亞基p47phox和p40phox基因，并對其編碼的氨基酸序列進行了分析，同時對這2個亞基在草魚不同組織中的差異表達情況檢測，以期了解NADPH氧化酶在魚類免疫調節中的作用及為魚類疾病爆發的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用草魚體重200 g左右，來自中科院水生生物研究所關橋養殖場。運回實驗室后，暫養5 d，恒溫(20±2)℃，空氣充氧，暫養過程中每天投喂一次人工飼料。Trizol試劑購自Invitrogen 公司；Ex-Taq聚合酶、DL-2000 Marker、pMD-18Tvector均購自TaKaRa公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit：購自美國Thermo公司；iQTM SYBR?Green Supermix：購自美國Bio-Rad公司；膠回收試劑盒購自Omego公司；其它試劑均為國產分析純。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由本實驗室保存。

1.2 引物的設計與合成

根據NCBI Genbank數據庫中斑馬魚和鯉魚的NADPH氧化酶p40phox和p47phox亞基cDNA序列保守區設計簡并引物，擴增中間片段，RACE擴增所需特異性引物根據擴增出來的中間片斷設計，熒光定量PCR擴增所需引物根據全長cDNA序列設計。所有引物均由上海生工生物公司合成(表1)。

表1 克隆及檢測草魚NADPH氧化酶p40phox和p47phox亞基的引物Tab.1 Primers used in cloning and decting p40phox and p47phox subunit of NADPH oxidase of C.idellus

續表1

注：R：A/G;Y：C/T;M：A/C;K：G/T;S：C/G;W：A/T;B：C/G/T;D：A/G/T;H：A/C/T;V：A/C/G.

1.3 RNA的提取和SMART cDNA的合成

取草魚頭腎和脾臟混合，按Trizol試劑盒說明書介紹的方法提取混合組織的RNA。瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質量。按照Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit方法進行第一鏈cDNA合成。具體操作按說明書進行。

1.4 各亞基中間片段及全長cDNA的擴增

根據表1所列引物，以第一鏈cDNA做為模板，先用簡并引物擴增出基因的cDNA片段，再根據各個基因對應的特異性引物，用5′-RACE引物和SMART5′錨定引物(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′)擴增基因的5′端，用3′-RACE引物和SMART 3′錨定引物(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′)擴增基因的3′端。擴增產物經克隆、測序后，拼接基因的5′端和3′端序列，獲得各基因的全長cDNA序列。

1.5 基因的氨基酸推測和序列比較分析

將測序所得到的cDNA序列用NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTN、BLASTX和TBLASTX軟件進行同源基因的搜索，查找與其相關的同源序列；氨基酸序列的推斷和疏水性分析通過ExPASy網站上(http://www.expasy. org/)的軟件完成；氨基酸序列同源性比較由ClustalW2.1程序完成。結構域分析用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de)預測。

1.6 不同組織的差異表達分析

用實時熒光PCR方法定量分析草魚NADPH氧化酶2個調節亞基在草魚組織表達分布的狀況，檢測和分析方法參照文獻[14]。分別提取健康草魚胸腺、心、頭腎、鰓、腸、肝、腎、脾和皮膚中的RNA，逆轉錄成cDNA。用Real-time PCR引物擴增各基因序列(表1)，PCR產物用DNA膠純化試劑盒純化后克隆進入載體pMD18T。質粒DNA經純化后用于制作標準濃度曲線，曲線的斜率應在-3.6與-3.2之間，相關系數應大于0.96。以草魚各組織樣品cDNA為模板，進行熒光定量PCR，PCR反應體系和反應條件與上述建立標準曲線的一致。利用CFX96TM Real-Time System(BIO-RAD)自帶CFX Manager軟件觀察熒光定量的結果以及數據的導出，通過Excel工具計算目的基因與內參基因拷貝數比值來確定草魚p47phox和p40phox基因mRNA水平的相對表達量，即以相對于內參基因β-actin的歸一化認定值表征目的基因的表達水平。每樣品重復3次，結果計算采用Livak的2-ΔΔCT方法[15]。

2 結果

2.1 草魚p47phox和p40phox基因cDNA全長的克隆及特征

取草魚頭腎和脾臟混合，提取RNA，以反轉錄所得cDNA為模板，通過簡并引物進行巢式PCR，獲得大小為703 bp的p47phox片段和大小為875 bp的p40phox片段;通過5′RACE-PCR擴增，獲得長度為774 bp的p47phox5′端片段和長度為182 bp的p40phox5′端片段；通過3′RACE-PCR擴增，獲得大小為486 bp的p47phox 3′端片段和1 335 bp的p40phox 3′端片段，PCR產物凝膠電泳結果見圖1和圖2 。對所獲得的片段進行拼接，得到大小為1 589 bp的p47phox亞基cDNA全長序列，ORF為1 233 bp，5′UTR長度為49 bp，3′UTR長度為307 bp，包含加尾信號和25 bp的poly(A)尾各1個，無mRNA不穩定信號。由cDNA序列推斷：p47phox亞基編碼由410個氨基酸組成的肽鏈，預測其相對分子質量為47.77×103，理論pI為8.08。同時得到大小為2 103 bp的p40phox亞基cDNA全長序列，ORF為1 068 bp，5′UTR長度為28 bp，3′UTR長度為1 007 bp 包括1個29 bp的加尾信號、5個poly(A)尾，無mRNA不穩定信號。由cDNA序列推斷：p40phox亞基編碼由355個氨基酸組成的肽鏈，預測其相對分子量為45.68×103，理論pI為7.83。由2個cDNA序列推斷的肽鏈序列均無信號肽和跨膜區，因此推斷草魚p47phox/p40phox為非分泌型蛋白。

圖1 草魚p47phox同源片段、5′RACE、3′RACE電泳圖Fig.1 Electrophoresis results of homologous fragment，5′RACE，3′RACE of p47phox in C.idellusM:DL2000 marker；1:p47phox同源片段PCR產物；2:5′RACE—PCR產物；3:3′RACE—PCR產物

圖2 草魚p40phox同源片段、5′RACE、3′RACE電泳圖Fig.2 Electrophoresis results of homologous fragment，5′RACE，3′RACE of p40phox in C.idellusM:DL2000 marker；1:p40phox同源片段PCR產物；2:5′RACE—PCR產物；3:3′RACE—PCR產物

2.2 草魚與其他動物的對應調節亞基的氨基酸序列比對

用BLAST程序對草魚NADPH氧化酶2個調節亞基p47phox/p40phox編碼的肽鏈進行同源性比較。結果發現：草魚NADPH氧化酶2個調節亞基與團頭魴、鯉魚和斑馬魚的同源亞基的氨基酸序列同源性在81%～96%之間，而與墨西哥脂鯉、大西洋鮭和白斑狗魚等魚類對應亞基同源性在68%～74%之間。推斷p47phox亞基含有1個PX 結構域(Val6-Glu123)、2個SH3結構域(Ser162-Pro214；Leu232-Arg284)、1個PC基序(motif)(Pro354-Gln408)。P40phox亞基含有PX結構域(Asn19-Gln140)、SH3結構域(Arg170-Ile223)、PB1結構域(Ser249-Ala344)各1個。p47phox和p40phox編碼肽鏈同源性比對及功能域分析結果見圖3和圖4。另外，通過CLUSTAL比對顯示這兩個亞基的結構域與人、鼠、野牛等哺乳動物對應的亞基蛋白質序列的結構域和功能位點基本上匹配，說明這些亞基的功能與哺乳動物對應的亞基相似。

圖3 草魚p47phox同源比對結果及功能域分析Fig.3 Alignment of p47phox amino acid sequences of C.idellus and the function domain analysis箭頭分別指示PX結構域、2個SH3結構域的結合位點及PC motif，假定的p67phox結合位點。

2.3 p40phox和p47phox亞基在草魚不同組織中差異表達分析

通過實時定量PCR分析：NADPH氧化酶2個調節亞基p47phox和p40phox在草魚胸腺、心、頭腎、鰓、腸、肝、腎、脾和皮膚等不同組織中的表達強度不同(圖5)。在9種組織中都能檢測到這兩種亞基的表達。其中p47phox基因在皮膚，心臟和胸腺中表達最高，其次是鰓，肝臟，脾臟和頭腎，但不同組織之間沒有顯著性差異(P>0.05)。p40phox在心臟、胸腺和皮膚中表達最高，其次是腸、頭腎、脾臟，在肝、鰓和腎中也有表達，但不同組織之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖4 草魚p40phox同源比對結果及功能域分析Fig.4 Alignment of p40phox amino acid sequences of C.idellus and the function domain analysis箭頭分別指示PX結構域、SH3結構域及PB1結構域的結合位點。

圖5 p47phox和p40phox在草魚不同組織中的mRNA水平分析Fig.5 Analysis of mRNA level about p47phox and p40phox gene of different tissues in C.idellus

3 討論

本研究通過同源性比對設計引物，結合RT-PCR與RACE-PCR技術，克隆獲得草魚NADPH氧化酶2個調節亞基p47phox和p40phox基因的cDNA全長序列，通過軟件分析，發現預測的氨基酸序列具有Nox/Duox家族蛋白特征結構域，即N端PX結構域、SH3結構域、PC基序和PB1結構域，這些結構域與NADPH氧化酶抗菌免疫功能相關[16]。對這些結構域的分析，為我們下一步研究其免疫功能奠定基礎。而且這些結構域與人、鼠、野牛、海豚等哺乳動物對應的亞基蛋白質序列的結構域和功能結合位點基本上吻合，說明這些亞基在魚類中的功能與哺乳動物對應的亞基相似，但有待進一步試驗證實。氨基酸序列比對分析表明所克隆得到草魚的p47phox和p40phox基因與其他物種具有較高的同源性，這說明NADPH這兩個亞基在進化上相當保守，同時也表明物種分類關系與進化地位相匹配。

Nox/Duox家族蛋白結構特征中的PX結構域是維持其激活功能的關鍵位點，如Arg57、Arg58、Tyr59、Arg105[16-17]在草魚中也存在，這幾個關鍵位點如果缺失或突變，NADPH氧化酶將無法發揮抗菌免疫調節功能[17]。人類的p40phox與p47phox亞基的PX結構域能選擇性識別PtdInsP3和PtdInsP2，然后被磷酸化，并被激活，組裝，活化后的p40phox與p47phox由細胞質被轉運到細胞膜上，相互作用后進而裝配成有活性的NADPH氧化酶多酶復合體，發揮催化功能，促使ROS產生[17-18]。人類的p40phox的SH3結構域能與磷酸化后的p47phox C端的PRR結構域相互作用，PC基序也能與p67phox相互作用，然后3個催化亞基p40phox 、p47phox 與p67phox 相互作用并以1∶1∶1比例結合在細胞膜上形成復合體，發揮NADPH氧化酶的催化功能，促使ROS的產生[6]。草魚p40phox與p47phox具有類似于人的PX和SH3結構域。由此推斷草魚與人的NADPH氧化酶亞基都擁有相似的活化機制。

胡寶慶等[13]通過半定量PCR分析了翹嘴鱖p47phox和p40phox在各種組織中的分布表達情況，這與我們在草魚中所得到結果有所不同。一方面可能是所用方法不同，Real-time RCR相對更靈敏、準確、可靠。另一方面可能是p47phox和p40phox調節亞基mRNA在不同物種中組成型表達情況有所不同。因為不同物種在不同生長階段如幼魚或成魚階段，p47phox和p40phox基因在不同組織中分化不同，豐度不同，因此表達量不同。在本研究中，所采用的是200 g左右的魚，而胡寶慶等[13]是用400 g左右成魚，因此p47phox和p40phox表達量存在差異。其次魚體在不同飼養環境中如水質或溫度中，魚類為維持自身的免疫穩態，各組織發揮的免疫功能不同因而表達量有所差異。然而，本研究與鯽、紅鰭東方鲀的表達模式基本相吻合[18]。可能是因為魚類的胸腺、頭腎這兩個重要的免疫組織含有豐富的吞噬細胞，同樣作為造血組織的心臟也可能NADPH氧化酶表達量高[19]。皮膚、腸作為魚類主要的黏膜相關淋巴組織，也含有較為豐富的吞噬細胞[20-21]。這些吞噬細胞都能夠產生NADPH氧化酶，從而促進呼吸爆發[22-23]，而發揮抗菌免疫作用。有趣的是，我們發現p47phox和p40phox在各組織中分布表達略有差異，但是差異不顯著，這可能是機體的免疫狀態和各亞基基因的轉錄時間差異造成的。

本研究證明所克隆獲得的草魚p47phox和p40phox與團頭魴、鯉、斑馬魚p47phox和p40phox基因具有較高的同源性，分析了草魚p47phox和p40phox基因在各個組織器官中的表達分布情況。以期能夠為揭示p47phox和p40phox在抗菌免疫反應及對免疫相關基因的調控作用奠定研究基礎。

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