響應面法優化刺梨果醋的發酵條件

李小紅，陽如詩，魏韶，張小松，吳德智

(貴州理工學院，貴陽 550003)

刺梨(RosaroxbunghiiTratt)是薔薇科多年生落葉叢生灌木繅絲花的果實，果實多為扁球形漿果，成熟時為黃棕色[1]，是集保健、藥用及食用為一體的綠色水果[2]，具有獨特的芳香味，營養豐富，含有很多生物活性物質，包括具有抗氧化作用的黃酮、類黃酮、VC、VP(蘆丁)等，有“三王水果”之稱[3]。但是刺梨果汁含有大量的單寧等多酚物質[4]，具有較強的苦澀味[5]，因此直接食用會影響口感。

以水果或果品加工下腳料為主要原料，以酒精發酵及醋酸發酵釀制而得到的營養豐富、風味獨特的調吳德智(1983-)，男，副教授，博士，研究方向：食品藥品研究與開發。

味品定義為果醋。果醋既有水果和食醋的營養保健功效，又是具有營養、保健及食療等功能為一體的新型調味品[6,7]。刺梨釀制成果醋，不僅可以解決刺梨口感問題，同時還保留了刺梨原有的營養物質，并且發酵之后的產品吸收更好，增加刺梨的附加值[8-10]。

單因素試驗分別對刺梨果醋醋酸發酵過程的接種量、發酵溫度、發酵時間及裝液量4個因素的最佳工藝參數進行探討，然后通過響應曲面法對以上4個因素進行優化，獲得刺梨果醋發酵的最佳工藝條件，為刺梨果醋工廠化生產提供理論依據，為刺梨深加工產品的不斷開發利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑

果酒酵母1969、醋酸桿菌20056：中國發酵工業研究所(CICC)；刺梨：本地人工種植，充分成熟，新鮮無霉爛變質；酵母浸粉、葡萄糖、瓊脂：天津市華東試劑廠；其他試劑：均為分析純。

1.2 儀器及設備

DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 上海上天精密儀器有限公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計 梅特勒-托利多國際股份有限公司； FA1004B型電子天平 上海越平科學儀器有限公司；九陽 JYZ-E6型榨汁機 九陽股份有限公司；J0050024型生化培養箱 上海福瑪試驗設備有限公司；WF32型精密色差儀 深圳威孚光電科技有限公司；PX-A1T型酒精濃度計 廣州市普析通用儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 刺梨果醋制作工藝流程[11]

1.3.2 操作過程

1.3.2.1 原料清洗

通過流動水漂洗挑選出成熟、飽滿、無蟲害及無霉爛變質的刺梨。

1.3.2.2 破碎、酶解

將清洗處理好的刺梨果實打漿，為了提高出汁率，酶解時添加果膠酶55 mg/L，在50 ℃保溫酶解3.0 h。

1.3.2.3 調整成分

為了充分滿足酵母發酵的需求，加白砂糖將糖度調整為17%。

1.3.2.4 滅酶及滅菌

高溫可以使酶失效，因此在成分調整后通過升高溫度達到滅酶及滅菌的目的，在90 ℃保溫20 min。

1.3.2.5 酒精發酵

在刺梨果汁中按照果汁量3%接種加入果酒酵母1969，在30 ℃，發酵5天左右。

1.3.3 刺梨醋酸發酵條件優化

1.3.3.1 單因素試驗

本試驗針對原料裝液量、發酵溫度、發酵時間及醋酸菌接種量4個因素，保持其中3個因素固定不變，進行單因素試驗，以多酚和黃酮為次要指標，醋酸產量為主要指標，確定混料設計所需的水平。

1.3.3.2 響應面試驗設計

以醋酸產量為主要指標，經過對刺梨果醋配方的單因素試驗，選擇混料優選范圍：醋酸菌接種量(A)(10%，12%，14%)、發酵時間(B)(9，10，11 天)、發酵溫度(C)(30，32，34 ℃)、裝液量(D)(8%，12%，16%)。采用Design-Expert 8.0.6軟件進行混料設計，并以醋酸含量為指標，從而選出最佳配方，試驗設計見表1。

表1 Box-Benhnken響應面試驗因子與水平表Table 1 The factors and levels of Box-Benhnken experiment design

1.3.4 指標測定及方法

1.3.4.1 基礎指標測定

醋酸產量測定，參考王穎等的方法[12]；色度值采用精密色差儀；酒精度采用酒度計。

1.3.4.2 總多酚的測定

采用福林酚法進行測定[13]。刺梨果醋適當稀釋，吸取1 mL，加入0.2 mL福林酚試劑，搖勻，放置3 min 后加入1 mL 10% Na2CO3溶液，充分混合后室溫下靜置1 h，于760 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸為標樣，制作標準曲線，得出總酚含量Y與吸光度X的標準方程： Y=0.4417X+0.0012，R2=0.9931，在1.0～15.0 mg/L濃度范圍內有良好的線性關系。

1.3.4.3 總黃酮的測定

本試驗采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量。參考白立敏等的方法[14]，精密稱取蘆丁標準品，40%乙醇配制得130.0 mg/L的蘆丁儲備液。準確移取儲備液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入40%乙醇4.0 mL，靜置5 min后加入5% NaNO3溶液0.5 mL，搖勻，靜置5 min后加入0.5 mL 的10% Al (NO3)3溶液，搖勻，靜置5 min，最后加入3 mL 4% NaOH溶液，以乙醇為溶劑定容至10 mL。充分搖勻，靜置15 min后，于510 nm下測定吸光度，同時以空白試劑作參比。以吸光度Y為縱坐標與濃度X為橫坐標(mg/L)，得標準回歸方程Y=0.1124X-0.0012，R2=0.9993。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 醋酸菌接種量對刺梨果醋醋酸發酵的影響

取刺梨酒精發酵后的樣品100 mL置于250 mL圓底燒瓶中，分別加入6%，8%，10%，12%，14%的醋酸菌接種量，在30 ℃的環境中靜置發酵8天，然后測定果醋中的醋酸含量，結果見表2。

表2 醋酸菌接種量對果醋的影響Table 2 The single factor experimental results of acetic acid bacteria inoculation amount

隨著接種量的升高，果醋中的醋酸含量先逐漸升高后趨于平衡。多酚、黃酮含量逐漸降低，且多酚減少幅度最大。當醋酸菌接種量為12%時，醋酸含量最高，為4.76 g/dL。在營養物質一定的條件下，接種量過大時，發酵液內醋酸菌的含量增大，導致消耗的營養也隨之增多，但是同時用于生成醋酸的底物又不變，從而導致醋酸產量相對降低[15]。

2.1.2 發酵時間對刺梨果醋醋酸發酵的影響

取刺梨酒精發酵后的樣品100 mL置于250 mL圓底燒瓶中，接種醋酸菌量為12%，裝液量為12%，在30 ℃下分別靜置發酵 7，8，9，10，11 天，測定果醋中的醋酸，結果見表 3 。

表3 發酵時間對果醋的影響Table 3 The single factor experimental results of fermentation time

隨著發酵時間的延長，果醋中的醋酸含量逐漸升高而后趨于平衡，在發酵第 11天時醋酸含量略有降低。當發酵時間為10天時，醋酸含量最高。此外，隨著發酵時間的延長，多酚、黃酮含量逐漸降低，且多酚減少幅度最大。在營養物質一定的條件下，發酵時間延長，發酵液內醋酸菌含量不斷增多，其消耗的營養也越多，同時用于生成醋酸的底物較少，從而使得產酸量也相對較低。

2.1.3 發酵溫度對刺梨果醋醋酸發酵的影響

取刺梨酒精發酵后的樣品100 mL置于250 mL圓底燒瓶中，接種醋酸菌量為12%，裝液量為12%，分別在 26，28，30，32，34 ℃下靜置發酵10 天，測定果醋中的醋酸，結果見表 4。

表4 發酵溫度對果醋的影響Table 4 The single factor experimental results of fermentation temperature

隨著發酵溫度的升高，果醋中的多酚及黃酮含量均下降，這是因為溫度升高營養物質分解速度加快導致。醋酸含量先升高后降低，當發酵溫度為 32 ℃時，醋酸含量最高，為4.86 g/dL。這是因為當發酵溫度過低時，醋酸菌的生長代謝比較緩慢，醋酸產量低，隨著溫度的升高生長代謝加快，醋酸含量隨之增加，但是當溫度過高時又會導致菌體老化，代謝性能降低。

2.1.4 裝液量對刺梨果醋醋酸發酵的影響

取刺梨酒精發酵后的樣品在裝液量為8%，12%，16%，20%，24%分別置于250 mL圓底燒瓶中，接種醋酸菌量為12%，32 ℃下靜置發酵10天，測定果醋中的醋酸，結果見表5 。

表5 裝液量對果醋的影響Table 5 The single factor experimental results of the volume of liquid

隨著裝液量的升高，果醋中的醋酸含量先升高后逐漸降低且降低效果明顯，這是因為醋酸菌是好氧菌，裝液量越多與空氣的接觸面積就越小，醋酸菌生成代謝得不到足夠的氧氣使醋酸發酵緩慢，醋酸產量反而減少。當裝液量為12%時，醋酸含量最高，為4.98 g/dL。此外，隨著發酵液裝液量的升高，多酚、黃酮含量逐漸升高。這是因為裝液量較少時，溶解氧過高會導致還原性物質多酚、黃酮的降解。

2.2 刺梨果醋發酵工藝條件的響應面優化

在單因素試驗的基礎上，選取接種量(10%，12%，14%)、發酵時間(9，10，11天)、發酵溫度(30，32，34 ℃)及裝液量(8%，12%，16%)4個對刺梨果醋發酵有較大影響的因素，采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Benhnken試驗，以刺梨果醋的量為指標優化發酵工藝條件，試驗設計見表6。

表6 響應面試驗設計及結果Table 6 The design and results of response surface analysis

續 表

2.3 Box-Benhnken響應曲面設計優化復合發酵果漿的發酵條件

采用Design-Expert 8.0.6 提供的Box-Benhnken試驗，對各因素進行擬合，得到多元回歸方程：R=4.95-0.013A+0.082B+0.023C-0.079D-0.055AB+0.005AC+0.037AD+0.005BC-0.048BD-0.0075CD-0.15A2-0.30B2-0.26C2-0.36D2。

對刺梨果醋醋酸含量的回歸模型進行方差及顯著性分析，結果見表7。

表7 感官評分回歸方程的方差與顯著性分析Table 7 Variance and significant analysis of regression equation of sensory scores

續 表

該模型方程有顯著性影響(P<0.0001)，失擬項不顯著(P=0.0612>0.05)，說明在本試驗條件下，該回歸模型所考察的因素足以反映試驗中發酵條件對刺梨果醋含量的影響。判定系數R2=0.9832，Radj2=0.9671，說明回歸模型與實驗值擬合較好，可用于刺梨果醋含量的理論推測和分析，各因素影響大小依次為：發酵時間>裝液量>發酵溫度>接種量。由F檢驗可知，一次項中發酵時間、裝液量對刺梨果醋的產量具有極顯著影響(P<0.01)；在二次項中接種量、發酵時間、發酵溫度以及裝液量對刺梨果醋的產量具有極顯著影響(P<0.01)；其他因素之間不顯著(P>0.05)。與圖1中3D效應面圖反映出的各因素間的交互作用相吻合。

圖1 各因素交互的3D響應面圖譜Fig.1 3D response surface of different interaction factors

由Design-Expert 8.0.6軟件得出刺梨果醋醋酸的最佳發酵工藝參數是接種量為11.65%，發酵時間為10.13天，發酵溫度為32.08 ℃，裝液量為11.58%，刺梨果醋醋酸含量為4.96 g/dL，為了便于生產，我們將接種量定為11.7 %、發酵時間定為10天、發酵溫度定為 32 ℃、裝液量定為11.6%。進一步驗證試驗，得出刺梨果醋醋酸含量為4.98 g/dL。該值與預測值比較近，因此選取此為刺梨果醋醋酸的發酵工藝參數。

3 結論

通過單因素和 Box-Benhnken響應面試驗，利用統計學的方法建立了刺梨果醋發酵條件的二次多項式模型：R=4.95-0.013A+0.082B+0.023C-0.079D-0.055AB+0.005AC+0.037AD+0.005BC-0.048BD-0.0075CD-0.15A2-0.30B2-0.26C2-0.36D2。

由Design-Expert 8.0.6軟件得出刺梨果醋醋酸的最佳發酵工藝參數是接種量為11.65%，發酵時間為10.13天，發酵溫度為32.08 ℃，裝液量為11.58%，刺梨果醋醋酸含量為4.96 g/dL，為了便于生產，我們將接種量定為11.7%、發酵時間定為10天、發酵溫度定為32℃、裝液量定為11.6%。與進一步驗證試驗數據基本吻合，也就是本試驗范圍內建立的模型準確有效，可用來預測刺梨果醋發酵工藝參數。得到的果醋醋香濃郁，味酸醇厚，營養成分豐富，具有很好的開發前景。

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