肺炎鏈球菌菌毛蛋白的結構功能研究

顏子乙 綜述，崔亞利,2，張 靜，郭思琪，顏靈逸，趙 雪，江詠梅,2△ 審校

(1.四川大學華西第二醫院檢驗科，成都 610041；2.婦兒疾病與出生缺陷教育部重點實驗室，成都 610041)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是上呼吸道常見的定植菌，菌體在突破機體免疫防御后，可引起肺炎、中耳炎、腦膜炎、敗血癥等局部或全身性感染，于5歲以下兒童和老年人群中有很高的發病率和病死率[1-2]。WHO將肺炎列為5歲以下兒童死亡的首要原因[3]，而兒童超過50%的重癥肺炎由S.pn引起，并且在死亡病例中占有更高比例[4]。

菌毛作為S.pn重要的蛋白疫苗候選因子，可通過增強對宿主細胞的黏附、識別細胞外基質、參與生物膜形成等方式，介導細菌黏附于宿主細胞表面，也具有侵襲作用，可誘導機體產生炎性反應[5]，進而在宿主組織定植和致病過程中發揮重要作用[6-7]，同時，在S.pn感染的患者血清中，也可檢測到抗菌毛蛋白抗體[8]。目前，已有學者對S.pn菌毛蛋白開展相關研究，并取得了階段性成果，但相關報道較為零散，缺乏系統性。本文將圍繞近年來S.pn菌毛蛋白的分型、結構特征和生物學功能的研究成果，并結合其作為蛋白抗原的免疫保護效果進行綜述，旨在為后續研究提供更多思考方向。

1 S.pn菌毛蛋白的分型及結構特征

與其他革蘭陽性細菌相似，S.pn菌毛為多個菌毛蛋白亞基共價裝配形成的聚合體，每個菌毛蛋白亞基均含有分選酶(sortase，Srt)特異性LPXTG樣基序，在特定的分選酶催化下，蛋白亞基間發生共價聚合，并將菌毛結構錨定在細胞壁表面的肽聚糖上[9]。

編碼S.pn菌毛的基因以基因島的形式存在，根據菌毛基因島和蛋白亞基結構的不同，目前共發現兩種類型的S.pn菌毛，Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛，前者由菌毛基因島(pilus islet，PI)-1編碼，是蛋白亞基RrgA、RrgB和RrgC形成的聚合體；后者由PI-2編碼，是蛋白亞基PitB的聚合體。由于PI具有可移動遺傳元件特征，S.pn菌株可同時表達兩種菌毛、僅表達一種菌毛或不表達菌毛。

1.1 Ⅰ型菌毛結構特征

Ⅰ型菌毛是S.pn中發現最早的菌毛，也是表達最廣的一類，流行率約為30%[10-11]。S.pn中編碼Ⅰ型菌毛的PI-1共包括7個基因，分別是正向調節基因rlrA、表面結構蛋白亞基基因rrgA、rrgB、rrgC和分選酶基因srtC-1、srtC-2、srtC-3(曾被稱為srtB,srtC,srtD)。其中，rrgA、rrgB、rrgC可編碼LPXTG樣基序(rrgA:YPRTG；rrgB:IPQTG；rrgC:VPDTG)，供分選酶識別催化亞基間的共價聚合，并將菌毛蛋白錨定到細胞壁表面[12]。

Ⅰ型菌毛遍布S.pn菌體表面，電鏡下直徑為2～6 nm[13]，長度可超過1.5 μm[14]，呈柔韌毛發樣，直接與細胞壁表面肽聚糖連接。Ⅰ型菌毛主要由rrgA、rrgB和rrgC構成，其中RrgA和RrgC為輔助蛋白，RrgB是主要的骨架蛋白。RrgB共包含4個結構域，空間構型呈鼻樣凸起，具有極性；蛋白亞基首尾連接組成蛋白原絲，2條蛋白原絲相互纏繞，構成S.pnⅠ型菌毛的主體結構[15]。由于PI-1的序列變異性，目前發現有3種亞型(RrgB cladeⅠ、RrgB cladeⅡ、RrgB cladeⅢ)，不同亞型的蛋白同源性為48%～60%，不同菌株的相同亞型之間蛋白同源性大于99%[16]，相同亞型間序列高度保守。

RrgA主要分布在Ⅰ型菌毛遠側端，成簇排列，為菌毛頂端蛋白，屬于黏附分子，介導菌毛的黏附功能，可與膠原蛋白、纖維連接蛋白和層黏連蛋白等連接。與其他革蘭陽性細菌相似，頂端蛋白RrgA不是S.pnⅠ型菌毛初始生成所必需的。RrgA蛋白包含4個結構域，包括1個整合素Ⅰ膠原識別結構域，這一區域由2條插入的“胳膊”折疊為1個帶正電的搖籃結構，以及3個莖形成結構域組成[17]。由于PI-1中編碼RrgA cladeⅠ與clade Ⅲ 同源性大于99%，RrgA僅分為兩種亞型；且兩種亞型間的變異主要集中在蛋白頭部，細長的莖部仍然保守[18]。RrgC主要分布在S.pnⅠ型菌毛近菌體端，呈單個蛋白排列，包含3個結構域，由2個異肽鍵連接，結構呈彎曲桿狀。在亞基的聚合過程中，RrgC不依賴PI-1編碼的分選酶，而是由管家分選酶SrtA催化，將S.pnⅠ型菌毛錨定在菌體表面[19]。與RrgA和RrgB不同，S.pn菌株中RrgC蛋白亞基高度同源(>98%)。

1.2 Ⅱ型菌毛結構特征

編碼S.pnⅡ型菌毛的PI-2共包括5個基因，分別是信號肽樣蛋白基因sipA、結構蛋白基因pitA,pitB和分選酶基因srtG1、srtG2，整個基因島位于蛋白酶T基因(PepT)和亞鐵螯合酶基因(HemH)之間[20-21]。近年來，S.pnⅡ型菌毛流行率增加，約為20%，主要與血清1型,2型,7F型,19A型和19F型相關[22]。Ⅱ型菌毛主要由結構蛋白PitB的重復單元組成，其共價聚合由同源分選酶SrtG1和信號肽樣蛋白基因SipA催化。PitB包含2個結構域，不同分子間的D1-D2結構域表達VTPTG基序，由SrtG1識別并首尾連接，而PitA和SrtG2并不是Ⅱ型菌毛形成所必須的[20]。作為新發現的S.pn菌毛類型，目前對S.pnⅡ型菌毛結構和功能的相關研究尚不深入。

2 S.pn菌毛的生物學功能

菌毛雖不是S.pn生存的必需結構，但作為介導菌體黏附宿主細胞的結構基礎和毒力因子，在S.pn侵襲性感染的初始階段發揮重要作用。

局部侵襲性感染是造成菌血癥的基礎，針對S.pn的呼吸系統感染，在S.pnⅠ型菌毛的黏附功能研究中，NELSON等[23]使用人肺泡上皮A549細胞作為宿主細胞，發現敲除rrgA的菌體，雖然形成菌毛結構，但黏附能力明顯降低；敲除rrgB和rrgC的菌體，雖未形成菌毛結構，但黏附能力與野生菌毛型相似。這一發現表明S.pnⅠ型菌毛的黏附功能由RrgA介導，而非菌毛主鏈。后續NELSON等[23]在對S.pnⅠ型菌毛免疫機制的初步探究中發現，與無菌毛株相比，菌毛株不僅在定植、致病和引發敗血癥方面更具優勢，還能有效誘發腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)的釋放，提升宿主的炎性反應水平。在S.pnⅠ型菌毛蛋白亞基RrgA與宿主免疫損害機制的研究中，ORRSKOG等[24]分別使用敲除和未敲除rrgA的菌株，通過鼻內和腹腔攻毒實驗，發現表達RrgA的菌株在野生型小鼠中，比使用補體受體3(CR3)抗體和CR3缺陷鼠更早出現敗血癥并有更快速的疾病進展，表明RrgA可通過與CR3的相互作用，影響巨噬細胞功能和全身感染狀態，RrgA-CR3介導的吞噬作用可促進局部感染向全身性感染擴散。同時，BASSET等[25]的研究表明，RrgA可通過活化Toll樣受體2(TLR2)，增強菌株的毒力和宿主的炎癥反應。

S.pn引起的呼吸系統以外的感染，多由病原菌呼吸道侵襲后形成的菌血癥發展而來。針對S.pn所致的腦膜感染，IOVINO等[26]通過靜脈攻毒實驗，發現菌毛株與無菌毛株相比，在腦中具有更高的菌體載量；當rrgA敲除后，菌毛株在腦中的載量下降。同時，表達RrgA的菌株更易分散形成單一球菌，對菌體通過血腦屏障起到促進作用。通過對黏附配體的進一步研究發現，RrgA可與血腦屏障上皮細胞表面的聚合免疫球蛋白受體(pIgR)和血小板內皮細胞黏附分子(PECAM-1)結合[27]，這兩種受體的下調具有預防S.pn腦膜炎的潛力。

針對S.pn所致的中耳感染，FIGUEIRA等[28]通過鼻腔攻毒制造中耳感染模型，并分析中耳液。結果發現，雖然S.pnⅠ型菌毛并非S.pn感染中耳的必要因素，但菌毛株與無菌毛株相比，有著更高的菌體載量，提示S.pnⅠ型菌毛對中耳感染也具有促進作用。以上研究表明，S.pnⅠ型菌毛在細菌黏附、侵襲性感染與宿主免疫損傷，以及感染灶轉移中均起到重要作用，RrgA蛋白亞基是其主要黏附因子和免疫介導因子。上述研究均表明，S.pnⅠ型菌毛的主要功能蛋白為RrgA,主要骨架蛋白為RrgB，S.pnⅠ型菌毛不僅具有黏附功能，還具有毒力作用，誘導宿主產生更嚴重的炎癥損傷，在宿主局部性和全身性免疫應答中起重要作用。

與S.pnⅠ型菌毛不同，BAGNOLI等[20]通過對A549細胞的黏附實驗發現，S.pnⅡ型菌毛通過PitB蛋白亞基和主鏈的結構構型，由骨架蛋白本身產生黏附效應，其黏附能力弱于RrgA。膠原蛋白、纖維連接蛋白和層黏連蛋白是S.pnⅠ型菌毛和S.pnⅡ型菌毛共同的黏附配體。綜上所述，S.pn菌毛具有介導菌體黏附、組織定植、屏障侵襲，誘導機體炎癥損傷等功能，在感染過程中發揮重要作用。

3 S.pn菌毛蛋白作為疫苗候選蛋白的潛力

目前，傳統的S.pn多糖疫苗(pneumococcal polysaccharide vaccine,PPV)和結合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine,PCV)已在部分國家和地區納為計劃免疫范圍。但由于幼兒免疫系統發育未完全成熟，PPV所使用的多糖抗原不能在2歲以下兒童中產生有效的免疫保護[29]；PCV雖能引起有效的免疫應答，但覆蓋血清型有限，且制造成本高，價格昂貴。有文獻報道[30]，在計劃免疫PCV7后，人群S.pn患病率未出現明顯改變，而在S.pn流行株中非疫苗型菌株比例逐漸增加。此結果提示，在大規模使用血清型依賴疫苗后，S.pn流行株出現了血清型置換，降低了疫苗對人群的保護效果。

大量研究表明，多種S.pn毒力因子可作為新型蛋白疫苗的候選抗原，為S.pn感染提供廣譜的保護效果，如膽堿結合蛋白(choline-binding protein,CBPs)、S.pn表面蛋白A和C(pneumococcal surface protein,PspA/PspC)、S.pn熱休克蛋白(heat shock proteins,Hsp40/DnaJ)、S.pn表面黏附素(pneumococcal surface adhesin A,PsaA)及溶血素(pneumolysin,Ply)等[31-36]。然而，目前還沒有商品化的蛋白疫苗能夠100% 抵抗S.pn感染，繼續尋找新的蛋白抗原位點不僅能有效促進蛋白疫苗的發展，還能通過免疫保護機制的研究，為藥物作用靶點及保護效果更好的疫苗研發提供理論依據。

有研究表明，在傳統S.pn疫苗免疫人群的初始階段，由于疫苗型菌株的迅速減少，S.pnⅠ型菌毛在流行株中的表達短時間內急劇下降；但隨后S.pnⅠ型菌毛的表達呈逐年上升態勢，甚至超過傳統疫苗普及前水平[37]，特別是在疫苗型菌株和耐藥型菌株中，說明S.pn的PI具有可移動遺傳元件特征，S.pnⅠ型菌毛對流行株的致病力和抵抗力有重要作用，可作為蛋白疫苗發展的候選抗原靶位進行深入研究。

現階段S.pn菌毛蛋白疫苗的初步研究也主要針對S.pnⅠ型菌毛，其細小絲狀的結構，可以很好地暴露在宿主免疫系統之下。GIANFALDONI等[38]使用重組S.pnⅠ型菌毛蛋白，評估免疫不同蛋白后，對避免小鼠發生S.pn菌血癥的保護作用，發現RrgA、RrgB和RrgC均可刺激機體產生特異性抗體，其中RrgA和RrgB具有免疫保護作用，可明顯延長受致死性S.pn劑量攻擊小鼠的生存時間，而單一RrgC抗原蛋白免疫小鼠的保護作用欠佳。有研究發現，RrgA的兩種亞型之間存在交叉免疫，RrgA clade Ⅱ型抗原免疫可保護小鼠免受RrgA clade Ⅰ型菌株的致死劑量攻擊[18,39]，表明RrgA不僅具有免疫原性，還具有很好的保守性，是理想的菌毛疫苗候選蛋白。但RrgB的3種亞型之間無法形成交叉保護效果，針對RrgB的這一問題，研究人員使用S.pn TIGR4(RrgB cladeⅠ),S.pn 6BSPEC(RrgB cladeⅡ)和S.pn 35BSME15(RrgB cladeⅢ)的rrgB基因，構建出包含3種RrgB亞型的融合蛋白RrgB321，不同亞型的亞基之間使用Gly-Ser-Gly- Gly-Gly-Gly連接，使融合蛋白能夠正常折疊。新構建的融合蛋白抗原RrgB321在主動免疫實驗和被動免疫實驗中，對避免小鼠產生S.pn菌血癥具有較好的保護效果，其中在菌毛菌株中的抗血清介導的補體依賴性細菌吞噬作用水平與PCV7相當，表明RrgB321組分疫苗能成功形成針對S.pnⅠ型菌毛菌株的免疫保護作用，可覆蓋總體S.pn菌株的30%以上。

目前，諾華公司研發的RrgB融合蛋白疫苗正處于臨床前研究中[39]，通過鼻內黏膜免疫的途徑，可在小鼠實驗性S.pn中耳炎的病程初期降低中耳液中菌體載量。而菌毛蛋白疫苗由于抗原靶位的限制，僅針對菌毛株產生免疫保護作用，無法避免無菌毛株對宿主的侵襲性感染；在有菌毛蛋白抗體的環境中，菌體也可選擇性不表達菌毛，逃避免疫攻擊。為突破菌毛蛋白這一局限性，在進一步研究中，可與菌體保守蛋白聯合制備多價疫苗，加強疫苗的免疫覆蓋范圍。例如，在S.pn膽堿結合蛋白A(PcpA)、S.pn組氨酸三聚體蛋白D(PhtD)、S.pn溶血素(dPly)組成的三聯蛋白疫苗和由流感嗜血桿菌蛋白D、dPly、PhtD組成的三聯蛋白疫苗已進入臨床Ⅱ期試驗的階段[40]，可將菌毛蛋白與這些較為成熟的蛋白疫苗組分進行配伍，發揮菌體蛋白保守性高和菌毛蛋白易被免疫系統識別的雙重優勢。同時，不同的免疫劑量、免疫途徑和免疫佐劑也可極大地影響菌毛蛋白疫苗的免疫效果，調整聯合疫苗不同抗原間蛋白配伍比例，嘗試多種免疫途徑，選用新型免疫佐劑，可使菌毛蛋白疫苗達到更好的保護效果[41]。

4 展 望

時至今日，人們對S.pn菌毛結構和生物學功能的研究已經逐漸深入，但對其作為蛋白疫苗的保護作用及發揮作用的機制還有待進一步研究。在PPV和PCV普及之后，面對S.pn出現的流行株變換、菌毛表達反彈等趨勢，人們對S.pn疫苗將抱有更多期待。菌毛不僅在S.pn致病過程中起到重要作用，同時在生物學功能、免疫原性、胞外表達、誘導抗體生成等方面均符合疫苗候選蛋白的選擇指標，在疫苗設計與研發中具有很大潛力。然而，對重組S.pn菌毛蛋白疫苗的保護效果評估，大多還處于單一組分、單一模型階段，缺乏同其他黏附蛋白或互補蛋白的聯合評價，以及多器官、與病毒共感染模型的構建。繼續尋找新的蛋白抗原靶位，評估新的蛋白疫苗聯合模式，仍將是S.pn蛋白疫苗的發展方向。