補腎活血方對腎虛血瘀薄型子宮內膜大鼠子宮內膜容受性的影響研究

尹曉丹，何軍琴，王景尚，薛曉鷗

子宮內膜對于維持女性月經和生育能力非常重要，在胚胎著床和妊娠過程中起關鍵作用。子宮內膜容易受流產、感染等因素的影響而形成薄型子宮內膜。薄型子宮內膜是指子宮內膜厚度低于能夠獲得妊娠的閾厚度，即＜7 mm［1］。目前治療薄型子宮內膜常用的藥物有雌激素、阿司匹林等［2-5］，但療效不確定［6-9］，因此尋找更有效的治療方案是目前臨床亟待解決的問題。

評價子宮內膜容受性的指標有子宮內膜厚度、形態學、間質、腺體以及子宮內膜血管等，這些指標均與妊娠結局有很大的關系。本研究旨在觀察補腎活血方對腎虛血瘀薄型子宮內膜大鼠子宮內膜容受性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2016年6月—2017年3月選取SPF級雌性SD大鼠42只，體質量200～220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號SCXK(京)2012-0001。動物適應環境3 d，自由飲水飲食，室溫（22±1）℃，濕度（40±10）%，光照周期12 h/12 h。

1.2 實驗藥物 實驗用中藥購自同仁堂藥店。補腎活血方由熟地15 g、菟絲子12 g、桑寄生12 g、覆盆子12 g、川斷12 g、川牛膝12 g、當歸12 g、丹參12 g、澤蘭12 g、川芎9 g、益母草20 g、雞血藤12 g、紅花9 g組成，藥物浸泡后煎煮。一劑藥煎煮2次，第一次煎煮先用大火煮沸后改用小火，再煎

本文創新點：

（1）本文為薄型子宮內膜的臨床防治和補腎活血治療提供了新思路；（2）首次疊加了腎虛血瘀模型和薄型子宮內膜模型；（3）通過相關作用機制的研究，為中藥治療薄型子宮內膜的推廣提供實驗依據。25 min，將藥液煎至100 ml左右濾出。第二次煎煮加涼水稍高于藥面，煮沸后再改用小火煎15 min左右，煎至100 ml左右濾出。將兩次煎煮的藥液混合均勻，再濃縮或稀釋到所需濃度。按人鼠體表面積換算，大鼠劑量為人的等效劑量；戊酸雌二醇（補佳樂，1 mg/片，拜耳公司，批號：J20130009），按人鼠體表面積換算，大鼠劑量為0.3 mg·kg-1·d-1；羥基脲（齊魯制藥有限公司，批號H37021289），按人鼠體表面積換算，大鼠劑量為450 mg·kg-1·d-1；高分子右旋糖酐（Dextran70，瑞士Amwesham Biosciences公司），按人鼠體表面積換算，大鼠劑量為5 ml/kg。

1.3 主要試劑 蘇木精染液、伊紅染液、生物素標記的山羊抗兔IgG、辣根酶標記鏈霉卵白素（均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），波形蛋白一抗、角蛋白一抗（購自Abcam公司）。

1.4 動物模型制備 將大鼠隨機分為對照組9只，造模組33只。參照《雌性大鼠腎虛血瘀模型初探》［10］建立腎虛血瘀薄型子宮內膜大鼠模型。造模組大鼠給予羥基脲450 mg·kg-1·d-1灌胃給藥8 d，于末次給藥30 min后尾靜脈快速推注10%高分子右旋糖苷5 ml/kg。羥基脲給藥8 d后，大鼠出現皮毛枯槁欠光澤、體型瘦小等腎虛癥狀；注射10%高分子右旋糖苷1 h后大鼠耳、爪、尾部顏色紫暗，提示腎虛血瘀造模成功。將腎虛血瘀模型大鼠腹部皮膚切開，進入腹腔定位子宮后，在宮角處注入0.3 ml 95%無水乙醇，保持宮腔充盈狀態，2 min后再次注入0.3 ml 95%無水乙醇，另一側操作相同，反復沖洗宮腔，關腹。造模結束后，分別從對照組和造模組隨機抽取3只大鼠處死，開腹取子宮，觀察子宮大體標本，并縱行剖開部分子宮暴露宮腔后浸入10%福爾馬林溶液中固定，常規HE染色后，在光鏡下觀察子宮內膜厚度。與對照組相比，模型組子宮壁全層變薄，子宮內膜層較肌層更明顯，且未見明顯波浪形，驗證模型造模成功。

1.5 動物分組及用藥 將造模組大鼠隨機分為模型組、補腎活血高劑量組、補腎活血中劑量組、補腎活血低劑量組、補佳樂組，每組6只。對照組灌服蒸餾水10 ml/kg；模型組灌服蒸餾水10 ml/kg；補腎活血低劑量組灌服補腎活血方2.16 mg/kg，10 ml/d；補腎活血中劑量組灌服補腎活血方4.32 mg/kg，10 ml/d；補腎活血高劑量組灌服補腎活血方8.64 mg/kg，10 ml/d；均為1次/d；補佳樂組灌服補佳樂0.3 mg·kg-1·d-1。給藥3個動情周期即15 d。

1.6 實驗方法 第15天給藥后1 h取材（開腹取子宮）。

1.6.1 HE染色 常規HE染色后，在光鏡下觀察子宮內膜各層厚度變化、腺體和血管分布情況，采用Leica qwin plus圖像處理軟件測量子宮內膜厚度、間質厚度。

1.6.2 免疫組化法檢測子宮內膜上皮細胞面積、間質細胞面積 銳性刮取子宮后壁內膜全層1 cm×1 cm，標本冷藏運送并在20 min內經機械分離和酶消化制成細胞懸液，然后通過二次篩網過濾法（100 μm和40 μm的濾篩）初步將基質細胞和上皮細胞分離，然后分別用有限稀釋法進行低密度培養，角蛋白和波形蛋白特異表達于上皮細胞和間質細胞，因此本研究利用角蛋白和波形蛋白的面積來反映上皮細胞和間質細胞的生長情況。

1.7 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析。計量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜HE染色結果 對照組子宮內膜結構完整，呈波浪形，腺上皮和腔上皮細胞完整，呈立方狀，腺體和血管數量正常；模型組子宮內膜厚度變薄，腺上皮和腔上皮細胞呈扁平狀，腺體稀少，毛細血管數量減少，內膜連續性差；補腎活血低、中劑量組子宮內膜結構欠完整，腺上皮及腔上皮細胞呈矮柱狀，腺體減少，毛細血管增多，內膜稍厚；補腎活血高劑量組、補佳樂組結構完整內膜比例增加，內膜連續，呈波浪形，大部分腺上皮和腔上皮細胞完整，呈單層立方狀，排列整齊（見圖1）。

2.2 各組大鼠子宮內膜厚度比較 6組大鼠子宮內膜厚度比較，差異有統計學意義（p＜0.05）。模型組大鼠子宮內膜厚度小于對照組，差異有統計學意義（p＜0.001）；補腎活血低、中、高劑量組及補佳樂組大鼠子宮內膜厚度大于模型組，差異有統計學意義（p＜0.05）；補佳樂組大鼠子宮內膜厚度大于補腎活血低、中、高劑量組，差異有統計學意義（p＜0.001，見表1）。

2.3 各組大鼠子宮間質厚度比較 6組大鼠子宮間質厚度比較，差異有統計學意義（p＜0.05）。模型組大鼠子宮間質厚度小于對照組，差異有統計學意義（p＜0.001）；補腎活血低、中、高劑量組及補佳樂組大鼠子宮間質厚度大于模型組，差異有統計學意義（p＜0.001）；補佳樂組大鼠子宮間質厚度大于補腎活血低、中劑量組，差異有統計學意義（p＜0.05，見表2）。

圖 1 各組大鼠子宮內膜形態（HE染色，×40）Figure 1 Endometrial morphology in rats of each group

2.4 各組大鼠子宮腺體數比較 6組大鼠子宮腺體數比較，差異有統計學意義（p＜0.05）。模型組大鼠子宮腺體數少于對照組，差異有統計學意義（p＜0.001）；補腎活血中、高劑量組及補佳樂組大鼠子宮腺體數多于模型組，差異有統計學意義（p＜0.001）；補佳樂組大鼠子宮腺體數多于補腎活血低劑量組，差異有統計學意義(p＜0.001，見表3）。

2.5 各組大鼠子宮血管數比較 6組大鼠子宮血管數比較，差異有統計學意義（p＜0.05）。模型組大鼠子宮血管數少于對照組，差異有統計學意義（p＜0.001）；補腎活血中、高劑量組及補佳樂組大鼠子宮血管數多于模型組，差異有統計學意義（p＜0.05）；補佳樂組大鼠子宮血管數多于補腎活血低劑量組，差異有統計學意義(p＜0.05，見表4）。

2.6 各組大鼠子宮內膜上皮細胞面積比較 6組大鼠子宮內膜上皮細胞面積比較，差異有統計學意義（p＜0.05）。模型組大鼠子宮內膜上皮細胞面積小于對照組，差異有統計學意義（p＜0.001）；補腎活血中、高劑量組及補佳樂組大鼠子宮內膜上皮細胞面積大于模型組，差異有統計學意義（p＜0.05）；補佳樂組大鼠子宮內膜上皮細胞面積大于補腎活血低劑量組、小于補腎活血高劑量組，差異有統計學意義（p＜0.05，見表5）。

2.7 各組大鼠子宮內膜間質細胞面積比較 6組大鼠子宮內膜間質細胞面積比較，差異有統計學意義（p＜0.05）。模型組大鼠子宮內膜間質細胞面積小于對照組，差異有統計學意義（p＜0.001）；補腎活血低、中、高劑量組及補佳樂組大鼠子宮內膜間質細胞面積大于模型組，差異有統計學意義（p＜0.001）；補佳樂組大鼠子宮內膜間質細胞面積大于補腎活血低劑量組、小于補腎活血高劑量組，差異有統計學意義(p＜0.001，見表 6）。

3 討論

薄型子宮內膜通常是指在黃體中期（排卵后6～10 d）子宮內膜厚度＜7 mm，其主要臨床特征為月經周期正常，但月經量過少。薄型子宮內膜不僅影響胚胎種植，還增加自然流產的風險，同時也是導致不孕及閉經的重要因素，給患者帶來極大心理壓力，因此，對薄型子宮內膜的發病機制與防治研究成為了國內外的難點與熱點課題。本研究擬通過建立腎虛血瘀薄型子宮內膜大鼠模型來探討補腎活血方對其子宮內膜組織形態學和細胞學的影響。結果提示，補腎活血方能夠改善子宮內膜的結構，在子宮內膜的厚度、間質厚度、腺體數以及血管數方面均有所提高。補腎活血方由熟地15 g、菟絲子12 g、桑寄生12 g、覆盆子12 g、川斷12 g、川牛膝12 g、當歸12 g、丹參12 g、澤蘭12 g、川芎9 g、益母草20 g、雞血藤12 g、紅花9 g組成。補腎填精、養血活血是中醫改善薄型子宮內膜的常用治法，補腎活血方基于以上理論，多年來經臨床反復驗證能有效改善薄型子宮內膜［11］。臨床上除了采用藥物治療薄型子宮內膜，也可以采用子宮內膜搔刮術來激發內膜的炎性反應和免疫反應，刺激內膜分泌相應的細胞因子和生長因子等［12］，從而增加子宮內膜容受性。此類方法雖然能夠改善子宮內膜容受性，但也有導致婦科炎癥等風險。

表 1 各組大鼠子宮內膜厚度比較（，μm）Table 1 Comparison of the endometrial thickness between rats of each group

表 1 各組大鼠子宮內膜厚度比較（，μm）Table 1 Comparison of the endometrial thickness between rats of each group

注：與對照組比較，ap＜0.05；與模型組比較，bp＜0.05；與補腎活血低劑量組比較，cp＜0.05；與補腎活血中劑量組比較，dp＜0.05；與補腎活血低劑量組比較，ep＜0.05

對照組 6 23.6±4.3模型組 6 9.3±0.7a補腎活血低劑量組 6 11.6±0.3b補腎活血中劑量組 6 13.0±0.5b補腎活血高劑量組 6 14.6±1.0b補佳樂組 6 18.1±0.8bcde F值 45.792 P值 ＜0.001

表 2 各組大鼠子宮間質厚度比較（，μm）Table 2 Comparison of the thickness of uterine stroma between rats of each group

表 2 各組大鼠子宮間質厚度比較（，μm）Table 2 Comparison of the thickness of uterine stroma between rats of each group

注：與對照組比較，ap＜0.05；與模型組比較，bp＜0.05；與補腎活血低劑量組比較，cp＜0.05；與補腎活血中劑量組比較，dp＜0.05；與補腎活血低劑量組比較，ep＜0.05

對照組 6 678.8±49.3模型組 6 154.3±21.1a補腎活血低劑量組 6 370.6±53.8b補腎活血中劑量組 6 471.2±26.0b補腎活血高劑量組 6 577.6±25.3b補佳樂組 6 522.3±12.8bcde F值 165.963 P值 ＜0.001

表 3 各組大鼠子宮腺體數比較（，個）Table 3 Comparison of the number of uterine glands between rats of each group

表 3 各組大鼠子宮腺體數比較（，個）Table 3 Comparison of the number of uterine glands between rats of each group

注：與對照組比較，ap＜0.05；與模型組比較，bp＜0.05；與補腎活血低劑量組比較，cp＜0.05

對照組 6 36±7模型組 6 14±4a補腎活血低劑量組 6 14±3補腎活血中劑量組 6 24±2b補腎活血高劑量組 6 32±10b補佳樂組 6 30±6bc F值 15.312 P值 ＜0.001

表 4 各組大鼠子宮血管數比較（，個）Table 4 Comparison of uterine vessels between rats of each group

表 4 各組大鼠子宮血管數比較（，個）Table 4 Comparison of uterine vessels between rats of each group

注：與對照組比較，ap＜0.05；與模型組比較，bp＜0.05；與補腎活血低劑量組比較，cp＜0.05

對照組 6 28.2±4.3模型組 6 16.3±2.2a補腎活血低劑量組 6 17.3±1.4補腎活血中劑量組 6 21.7±2.2b補腎活血高劑量組 6 21.8±2.3b補佳樂組 6 21.8±1.8bc F值 16.666 P值 ＜0.001

表 5 各組大鼠子宮內膜上皮細胞面積比較（，μm2）Table 5 Comparison of endometrial epithelial cell area between rats of each group

表 5 各組大鼠子宮內膜上皮細胞面積比較（，μm2）Table 5 Comparison of endometrial epithelial cell area between rats of each group

注：與對照組比較，ap＜0.05；與模型組比較，bp＜0.05；與補腎活血低劑量組比較，cp＜0.05；與補腎活血高劑量組比較，dp＜0.05

對照組 6 22.8±2.6模型組 6 6.8±1.4a補腎活血低劑量組 6 6.8±0.5補腎活血中劑量組 6 8.5±0.6b補腎活血高劑量組 6 15.0±0.6b補佳樂組 6 9.4±0.5bcd F值 145.854 P值 ＜0.001

表 6 各組大鼠子宮內膜間質細胞面積比較（，μm2）Table 6 Comparison of endometrial stromal cell area between rats of each group

表 6 各組大鼠子宮內膜間質細胞面積比較（，μm2）Table 6 Comparison of endometrial stromal cell area between rats of each group

注：與對照組比較，ap＜0.05；與模型組比較，bp＜0.05；與補腎活血低劑量組比較，cp＜0.05；與補腎活血高劑量組比較，dp＜0.05

對照組 6 11.1±1.0模型組 6 2.6±0.5a補腎活血低劑量組 6 5.0±0.3b補腎活血中劑量組 6 7.9±1.2b補腎活血高劑量組 6 13.7±0.8b補佳樂組 6 7.1±1.2bcd F值 116.054 P值 ＜0.001

中醫學古籍中沒有對“薄型子宮內膜”的記載。薄型子宮內膜的臨床表現主要為不孕，故中醫治療本病多歸結為“不孕”。中醫學認為，腎藏精，生天癸，主生殖，為沖任之本，育胎之根。若先天稟賦不足，腎氣虛弱，失于溫煦氣化，或早配頻產，以致耗傷精血，則天癸不充，腎封藏失職，沖任二脈失養，胞脈失養而不能攝精受孕。女子以血為本，血氣貴在流暢。七情內傷，素性抑郁，或忿怒過度，氣滯血瘀，瘀阻沖任，氣血運行受阻，種子艱難。又或流產金刃傷及胞宮胞脈，使胞宮受損，瘀血阻滯，或產后百脈空虛，抗病力弱，常傷腎傷血，造成胞宮損傷，由于損傷而自溢，死血瘀滯胞宮，氣滯血瘀，以致不能攝精成孕。近年來，隨著醫學研究的進一步深入，發現腎虛與血瘀二者在病因病機方面互為因果，互為影響，無論是腎陰虛還是腎陽虛均會發生因虛致瘀的病理表現［13］。因此，補腎填精、益氣養血活血是改善薄型子宮內膜的關鍵。宋殿榮等［14］觀察補腎活血方對妊娠大鼠子宮內膜容受性的改善情況發現，補腎活血方能明顯改善胚泡著床障礙大鼠子宮內膜表面胞飲突的發育，并顯著提高子宮內膜整合素αvβ3mRNA的表達，有助于子宮內膜容受性的建立，本研究結論與之相似。從現代藥理學角度分析，這可能是由于丹參、當歸有增加血管內皮細胞增殖的功效，而菟絲子、桑寄生等可使人著床期子宮內膜組織的血管內皮細胞生長因子及其受體數目均明顯增加，進而有利于子宮血管的生成，從而改善子宮血液循環，提高子宮內膜容受性，但其具體的作用機制將在進一步的研究中進行探討。

綜上所述，補腎活血方能夠增加子宮內膜各層厚度、腺體數、血管數以及上皮細胞、間質細胞面積。

作者貢獻：尹曉丹進行文章的構思與設計，文章的可行性分析，文獻/資料收集、整理，撰寫論文；何軍琴，王景尚進行論文的修訂，英文修訂；薛曉鷗負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責。

本文無利益沖突。

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