肛腸科外用凝膠劑的制備及其體外透皮性能考察

龐曉晨，成睿珍，趙靜

肛洗二號是一種熏洗湯劑，是天津市濱海新區中醫醫院肛腸科使用多年的臨床經驗方，由黃柏、槐花、苦參、白蘞、五倍子等十余種中藥組成，臨床常用于治療濕熱瘀阻型混合痔術后的水腫及疼痛，具有清熱解毒、消腫止痛的功效［1-2］。盡管此方臨床應用廣泛，但該劑型存在使用不方便、劑量不準確等缺點，為了克服上述不足，將傳統劑型改為外用凝膠劑。外用凝膠劑不但具有使用方便、黏性好、刺激性小等特點，而且提高了藥物維持時間，方便局部給藥［3］。凝膠劑中的藥物經皮膚吸收后，可在作用部位直接發揮藥效，避免了因胃腸道吸收而產生不良反應，且凝膠劑易于涂展和洗除，能吸收組織滲出液，不妨礙皮膚正常功能，有利于藥物吸收［4-6］。本研究在肛洗二號原方的基礎上，從中醫整體觀念出發，采用現代中藥制劑的開發研究方法，對其制備工藝進行優化研究，并通過改良擴散池法，對制劑的透皮性能進行考察，為保障和提高凝膠劑質量以及該制劑的進一步研究和臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 美國Waters超高效液相色譜系統（配有四元高壓梯度泵、在線真空脫氣裝置、自動進樣器、柱溫箱、TUV檢測器、Empower 色譜工作站）；十萬分之一分析天平（XP205，Mettler Toledo公司）；萬分之一電子天平（EN 1434，上海民橋精密科學儀器有限公司）；電熱套（北京中興偉業儀器有限公司）；高速離心機（Sorvall ST 16R，德國Thermo Fisher公司）；Milli-Q型超純水制備儀（美國Millipore公司）。

1.1.2 試劑與藥物 卡波姆? （Noveu，USA）；乙腈（色譜純，Fisher Scientific公司）；甲酸為色譜純蘆丁對照品（批號100080-201409），購自中國食品藥品生物制品檢定所；中藥飲片（購自天津市中藥飲片廠有限公司和北京盛世龍藥業有限公司，均符合相關規定［7］）。

2 制備方法

本研究時間為2016年9—11月。

2.1 肛腸外用凝膠劑的制備 分別選取濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的卡波姆為基質制備成水溶性凝膠劑。以外觀性狀、離心實驗、耐熱耐寒實驗為指標，篩選最佳濃度的基質。

2.1.1 外觀性狀及評分標準 外觀：黃色或黃褐色半固體、質地均勻、無分層現象；涂展性：易于涂展于皮膚或黏膜上；細膩度：均勻，涂布于手上無粗粒存在，在玻璃板上涂布薄薄一層時無肉眼可見的單獨顆粒或氣泡。評分標準：無分層現象、稠度適中、細膩光滑易涂展、保濕效果好為10分，部分分層、稠度較合適、稍有顆粒感易涂展、保濕效果一般為5分，完全分層、稠度過稠、有顆粒感不易涂展、保濕效果不好為0分。以不同濃度的卡波姆制成的凝膠基質外觀形狀評分見表1。

2.1.2 離心實驗及評分標準 將制備好的凝膠劑置于10 ml離心管中，3 000 r/min離心30 min（離心半徑10 cm），觀察有無分層現象。評分標準：無分層現象為20分，部分分層為10分，完全分層為0分。以不同濃度的卡波姆制成的凝膠基質離心試驗評分見表1。

2.1.3 耐熱耐寒實驗及評分標準 將制備好的凝膠劑分別置于-15 ℃冷凍箱24 h、55 ℃恒溫干燥箱6 h后取出，將置于冷凍箱的基質水浴加熱復融，分別觀察有無分層現象。評分標準：無分層為10分，部分分層為5分，完全分層為0分。以不同濃度的卡波姆制成的凝膠基質耐熱耐寒實驗評分見表1。

2.1.4 最佳濃度基質篩選 卡波姆濃度為0.5%和1.0%時凝膠基質為液體，能夠流動，不適合作為凝膠基質；而卡波姆濃度為2.0%時凝膠基質則略顯黏稠，卡波姆濃度為1.5%時制劑評分最高。

表1 不同濃度卡波姆為基質時凝膠劑的評分（分）Table 1 Scores of the formulation with different concentrations of carbomer

考慮到處方所用部位及涂布的困難程度，本研究最終選用1.5%作為處方的基質濃度。

2.2 體外透皮色譜條件 色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A 0.1%甲酸水溶液，B乙腈溶液；梯度洗脫：0～6 min，15% B；6～7 min，15%B～25% B；7～8 min，25% B；流速0.3 ml/min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μl。

2.3 對照品、供試品溶液的制備 對照品溶液：精密稱取適量蘆丁，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 ml含有4 100 ng蘆丁的對照品溶液。供試品溶液：稱取一定量凝膠劑于50 ml量瓶中，加入甲醇超聲溶解，溶解后甲醇定容，取出部分溶液于離心機內10 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取上清液，經0.20 μm有機濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 取對照品溶液、不加蘆丁的空白溶出物以及凝膠劑的透皮溶出物，采用超高效液相色譜（UPLC）法進行分析，結果顯示UPLC法對于本研究的專屬性較好（見圖1）。

圖1 超高效液相色譜圖Figure1 UPLC chromatogram

2.4.2 標準曲線制備 精密稱取對照品溶液，配成含205、410、820、1 640、2 050、4 100 ng/ml蘆丁的樣品溶液。按照2.2中的色譜條件行UPLC分析，記錄色譜峰面積（A）。以A為因變量（Y），以濃度（C）（ng/ml）為自變量（X）進行線性回歸分析，繪制A與C的標準曲線。標準曲線方程為Y=14.282X+862.32（r=0.999 9），線性范圍為205～4 100 ng/ml。

2.4.3 精密度實驗 精密吸取含410、1 640、2 050 ng/ml蘆丁的對照品溶液，連續進樣5次，連續進樣3 d，測定A，計算日內、日間精密度（RSD）。結果顯示3種濃度的對照品溶液日內RSD分別為1.07%、1.19%、1.82%，日間RSD分別為0.33%、1.96%、0.45%，表明儀器RSD良好。

2.4.4 重復性實驗 取凝膠劑適量，共6份，按2.3中的方法制備供試品溶液，進行含量測定。蘆丁的平均濃度為（488.9±7.8）ng/ml，RSD為1.58%，表明供試品溶液的方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率實驗 精密稱取已測定含量的樣品溶液適量，共6份，分別精密加入一定量的對照品溶液，按2.3中的方法制備供試品溶液進樣測定，計算加樣回收率，結果顯示，蘆丁的平均回收率（n=6）為100.35%，RSD＜2.00%（見表2）。

表2 透皮吸收加樣回收率實驗結果Table 2 Results of the recovery rats of transdermal absorption

2.5 體外透皮實驗

2.5.1 離體鼠皮的制備 剃去大白鼠腹部絨毛，脫頸處死，剝離皮膚。小心剔除皮下的脂肪組織及粘連物至皮膚成半透明狀；用0.9%氯化鈉溶液反復沖洗干凈，將破損處剪除，加入適量0.9%氯化鈉溶液浸沒鼠皮，密封放于冰箱（-20 ℃）中保存。

2.5.2 分組 分為制劑組和溶液組，制劑組使用自制的外用凝膠劑，溶液組使用肛洗二號提取后得到的復方湯劑。

2.5.3 體外透皮實驗方法 采用改良Franz擴散池法，將離體鼠皮固定在改良Franz擴散池的供給池和接受池之間，角質層面向供給池，以新鮮配制的接受遞質，預熱（32±1）℃，在供給池中加入制劑，于循環水浴（32±1） ℃中連續磁力攪拌（約300 r/min）。在實驗開始后分別于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h從接受池中取出2 ml接收遞質，同時向接受池中補加等量的供給液。樣品經0.22 μm微孔濾膜過濾后，UPLC法測定C，并以此計算累積滲透量（Q）、表觀滲透系數（Papp）及穩態流量（Jss）。

2.5.4 數據處理 采用UPLC法測定樣品含量，計算單位面積內藥物Q（μg/cm2），以Q對t/h做圖，得藥物累積滲透曲線。對所得曲線的直線部分進行回歸分析，斜率即為藥物的Jss（μg·cm-2·h-1）。

其中Cn為t時間藥物的測定濃度，Ci為t時間前的測定濃度，V0為接受池中溶液體積，V為取樣體積。

其中C0為供給池初始藥物濃度；A為有效透過面積；ΔQ/Δt可由累積透過量-時間曲線穩態部分的斜率求得。Jss= C0·Papp

2.5.5 體外透皮實驗結果 將樣品各時間點滲透量的均數與時間的關系，分別采用零級動力學、一級動力學、Higuchi方程、Ritger-Peppas方程4種數學模型進行擬合，分析其體外滲透性。溶液組和制劑組的透皮擴散均符合Higuchi方程，說明二者均有緩釋的作用。溶液組的滲透動力學方程為Q=0.964 8t1/2+7.678，r2= 0.926 8，制劑組的滲透動力學方程為Q=2.171 1t1/2+6.993 7，r2= 0.995 6（見表 3）。

表3 體外透皮實驗參數Table 3 Experimental parameters of in vitro transdermal experiments

從藥物累積滲透曲線（見圖2）可以看出，蘆丁在皮膚中的滲透可維持24 h 以上的穩態釋放速率。溶液組24 h內的Q 為（11.57±0.28）ng·cm-2·h-1，制劑組24 h 內的Q為（17.86±1.26）ng·cm-2·h-1，制劑組的Q是溶液組的1.54倍。溶液組的Papp和Jss分別為（12.43 ±1.26）cm/s 和（5.00 ±0.51）ng·cm-2·h-1，而制劑組的Papp和Jss分別為（26.29 ±3.49）cm/s和（12.70±1.68）ng·cm-2·h-1。兩組Papp和Jss比較，差異有統計學意義（tPapp=0.001，p＜0.01；tJss=0.001，p＜0.01）。

3 討論

3.1 外用凝膠劑的制備 水溶性凝膠劑是常用的透皮給藥劑型，是指藥物與形成凝膠的輔料溶解或分散在高分子材料中，形成的均一、混懸的黏稠液體或半固體制劑。本實驗將傳統劑型制備為外用凝膠劑，不但使其局部給藥更加方便、減少了刺激性，而且避免了因胃腸道吸收而產生不良反應，延長了藥物維持時間。

圖2 藥物累積滲透曲線（，n=5）Figure 2 Drug cumulative permeability curves

3.2 體外分析方法 本研究建立的體外分析方法不但分析速度快而且專屬性較強、靈敏度高。在既往文獻報道［8-9］的基礎上，本研究結果顯示，蘆丁在260 nm有較好的吸收，因此，選取260 nm作為蘆丁的最大吸收波長，以UPLC法作為分析方法，采用梯度洗脫，建立了體外透皮研究的含量測定方法。3.3 體外透皮實驗 本研究結果顯示，制劑組的Q是溶液組的1.54倍，且兩組的Papp和Jss間有明顯差異。說明與水溶液相比，凝膠制劑具有良好的經皮滲透性，能夠顯著增加單位面積的Q和Jss，有較好的透皮滲透性。

總之，本研究將傳統劑型制備為外用凝膠劑，不但使其局部給藥更加方便、減少了刺激性，而且避免了因胃腸道吸收而產生不良反應，延長了藥物維持時間。且與水溶液相比，凝膠制劑具有良好的經皮滲透性，能夠顯著增加單位面積的Q、穩態透皮速率，說明凝膠劑能顯著提高透皮滲透性。在今后的研究中，可以根據處方的特點，對促滲劑進行篩選，加入適合的促滲劑，以更好地提高凝膠劑的透皮效果。

作者貢獻：龐曉晨進行文章的構思與設計，文獻和資料的收集、整理，撰寫論文；成睿珍進行論文的修訂；趙靜進行論文的審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

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