“舒筋”手法對膝關節骨性關節炎家兔關節液白介素1β和5-羥色胺的影響研究

吳佳航，張弛，董思佳，尹浩

膝關節骨性關節炎（KOA）是臨床常見的骨性關節炎，是以關節軟骨退化及骨質增生為主要變化的慢性退行性疾病，主要癥狀為關節壓痛、疼痛、腫脹、僵硬、活動受限以及關節畸形等。該病多發于老年人，且其發病年齡愈趨年輕化。KOA的發病機制尚不完全清楚，本研究旨在通過建立兔KOA模型探索“舒筋”手法對KOA家兔關節液白介素1β（IL-1β）、5-羥色胺（5-HT）的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗家兔 2015年8—12月選取健康成年家兔50只，體質量2.0～2.5 kg，雌雄各半，采取單兔單籠，全程飼料喂養（成都中醫藥大學實驗家兔中心提供），自由飲水，自然日光照射，室溫15～25 ℃，濕度45%～55%。實驗通過醫學實驗家兔倫理和福利委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器設備 木瓜蛋白酶（美國Sigma公司，型號P3250）；玻璃酸鈉注射液（山東博士倫福瑞達制藥有限公司，規格2 ml∶20 mg）；家兔IL-1β ELISA試劑盒（Elabscience公司，AK0015OCT29007）、家兔5-HT ELISA試劑盒（Elabscience公司，AK0016MAR17009）；蘇木素-伊紅染液（武漢谷歌生物科技有限公司，G1005）；包埋機（武漢俊杰電子有限公司，JB-P5）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，RM2016）；正置光學顯微鏡（日本尼康公司，NIKON ECLIPSE CI）等。

1.3 研究設計

1.3.1 造模 50只家兔按隨機數字表法分為空白組12只和造模組38只，采用木瓜蛋白酶注射法于實驗第1、4、7天于造模組家兔右膝關節腔注射4%木瓜蛋白酶溶液制備家兔KOA模型。造模結束1周后，隨機抽取2只造模組家兔，檢驗造模成功與否，造模成功標準：家兔膝關節紅腫，跛行，膝關節沖洗液微黃稍混；處死家兔打開其膝關節腔，可見關節軟骨光滑度、色澤有明顯改變，軟骨表面出現糜爛或潰瘍，有纖維性增生及邊緣有骨贅形成等。

1.3.2 干預方法 將造模組剩余36只家兔按隨機數字表法分為模型組、玻璃酸鈉組和手法組，每組12只。空白組和模型組均常規飼養，未行治療；玻璃酸鈉組右膝關節腔注射玻璃酸鈉注射液0.2 ml，1次/周，共注射5次。手法組對家兔右膝關節行“舒筋”手法治療，12 min/次，隔日1次。“舒筋”手法參照《實驗針灸學》［1］《中國獸醫針灸學》［2］《兔針灸穴位的研究》［3］中家兔骨度分寸法取穴操作（見表1）。

1.3.3 標本采集與預處理 關節液采集。于造模成功后第8、12周末，每組各處死6只家兔，并將其固定于臺上，伸直右下肢，選取右股骨下緣與右膝髕韌帶外側緣相交處作為進針點。用1 ml注射器抽取0.9%氯化鈉溶液0.5 ml注入關節腔，反復抽吸3～5次，抽出微黃稍混的關節沖洗液0.3～0.6 ml，分別注入2 ml EP管，編號對應，于-80 ℃冰凍保存待用。并將留取的右膝關節，以內側切口緩慢打開膝關節腔行大體觀察并拍照記錄，手術刀取右股骨內、外、側髁處至軟骨下骨的軟骨組織塊，大小0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，切取右膝關節滑膜，大小0.3 cm×0.3 cm。

1.3.4 檢測指標與方法

1.3.4.1 家兔一般狀態觀察及改良Lequesne MG評分 造模成功后第8、12周末觀察各組家兔的精神狀態、體毛色澤、飲食等，并用改良Lequesne MG的膝關節級別評估方法［4］對家兔右膝關節局部反應、步態改變、關節活動范圍及腫脹程度等情況進行評估。

1.3.4.2 關節軟骨大體形態觀察及其評分 解剖各組處死家兔右側膝關節并暴露股骨遠端及脛骨平臺關節面關節軟骨，觀察關節軟骨光滑度、色澤及表面是否有糜爛及潰瘍、是否有纖維性增生及邊緣是否有骨贅形成等，根據關節軟骨大體形態學觀察評分原則進行關節軟骨大體評分［5］。

1.3.4.3 關節軟骨組織學觀察及Mankin's評分 將采集到的第8、12周末家兔軟骨組織塊制成厚度為4 μm的切片，行HE染色，光鏡下觀測右股骨內、外、側髁處至軟骨下骨的軟骨，按Mankin's評分標準［6］對關節軟骨的層次、軟骨細胞、軟骨下骨組織的變化進行評分，并拍攝照片。

1.3.4.4 ELISA法測定關節液中IL-1β、5-HT 從-80 ℃冰柜中取出處理好的關節液，按照試劑盒上說明書進行IL-1β、5-HT檢測。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，組內比較采用配對t檢驗。以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀態觀察及改良Lequesne MG評分 第8周末時空白組、玻璃酸鈉組、手法組家兔的精神狀態良好，毛發光澤，飲食正常；模型組家兔精神稍差，毛發光澤稍減低，飲食減少。第12周末時，空白組、玻璃酸鈉組、手法組家兔的精神狀態良好，毛發光澤，飲食正常；模型組家兔精神好轉，毛發較前光澤，飲食較前增加。

4組第8、12周末改良Lequesne MG評分比較，差異均有統計學意義（p＜0.05）。第8、12周末模型組、玻璃酸鈉組、手法組改良Lequesne MG評分高于空白組，差異有統計學意義（p＜0.05）；第8、12周末玻璃酸鈉組、手法組改良Lequesne MG評分低于模型組，差異有統計學意義（p＜0.05）；第8、12周末玻璃酸鈉組改良Lequesne MG評分與手法組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。第8周末空白組、模型組改良Lequesne MG評分與第12周末比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；第8周末玻璃酸鈉組、手法組改良Lequesne MG評分高于第12周末，差異有統計學意義（p＜0.05，見表2）。

2.2 關節軟骨大體形態觀察及其評分 第8周末，空白組右膝關節軟骨表面光滑，無明顯骨贅，色澤如常，軟骨完整。模型組關節軟骨表面粗糙，部分可見明顯骨贅形成，色澤灰暗，部分軟骨剝脫并暴露軟骨下骨。玻璃酸鈉組關節軟骨表面稍粗糙，未見明顯骨贅形成，色澤稍灰暗。手法組關節軟骨表面欠光澤，部分可見極少量骨贅形成。第12周末，空白組、模型組較前無明顯變化，玻璃酸鈉組、手法組關節軟骨表面較前稍顯光滑，光澤度較前好轉。

表 1 “舒筋”手法操作要點Table 1 Operating points of massage with the "relaxing tendons" technique

表 2 4組改良Lequesne MG評分比較（x±s，分）Table 2 Comparison of the modified Lequesne knee score at the end of 8th and 12th weeks of intervention between the blank group and 3 subgroups

4組第8、12周末關節軟骨大體評分比較，差異有統計學意義（p＜0.05）。第8、12周末模型組、玻璃酸鈉組、手法組關節軟骨大體評分高于空白組，差異有統計學意義（p＜0.05）；第8、12周末玻璃酸鈉組、手法組關節軟骨大體評分低于模型組，差異有統計學意義（p＜0.05）；第8、12周末玻璃酸鈉組關節軟骨大體評分與手法組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。第8周末空白組、模型組關節軟骨大體評分與第12周末比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；第8周末玻璃酸鈉組、手法組關節軟骨大體評分高于第12周末，差異有統計學意義（p＜0.05，見表3）。

2.3 關節軟骨組織學觀察及Mankin's評分 光鏡下顯示，第8周末:空白組軟骨細胞排列整齊，數目正常，無明顯增生或減少，無明顯細胞簇聚現象，軟骨表面平滑（見圖1A，本文圖1～2彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章）。模型組部分軟骨細胞排列整齊，數目基本正常，但可見細胞簇聚現象，部分軟骨表面可見損傷（見圖1B，箭頭所示）。玻璃酸鈉組軟骨細胞數量減少，排列不齊，基質中可見縫隙，軟骨表面不平滑（見圖1C，箭頭所示）。手法組部分軟骨細胞排列不齊，可見細胞簇聚，軟骨外膜不平滑（見圖1D，箭頭所示）。

第12周末：空白組軟骨細胞排列整齊，數目基本正常，無明顯增生或減少，無明顯細胞簇聚現象，軟骨表面平滑（見圖2A）。模型組軟骨細胞排列不齊，可見細胞簇聚；軟骨外膜可見損傷，軟骨表面不平滑（見圖2B，箭頭所示）。玻璃酸鈉組軟骨細胞排列不太整齊，較第8周末稍整齊，數目增多；軟骨表面不太平滑（見圖2C，箭頭所示）。手法組部分軟骨細胞排列不齊，較第8周末稍整齊，無明顯細胞簇聚；軟骨較表面平滑，無明顯損傷（見圖2D，箭頭所示）。

4組第8、12周末Mankin's評分比較，差異有統計學意義（p＜0.05）。第8、12周末模型組、玻璃酸鈉組、手法組Mankin's評分高于空白組，差異有統計學意義（p＜0.05）；第8、12周末玻璃酸鈉組、手法組Mankin's評分低于模型組，差異有統計學意義（p＜0.05）；第8、12周末玻璃酸鈉組Mankin's評分與手法組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。第8周末空白組、模型組Mankin's評分與第12周末比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；第8周末玻璃酸鈉組、手法組Mankin's評分高于第12周末，差異有統計學意義（p＜0.05，見表4）。

2.4 4組關節液中IL-1β、5-HT比較 4組第8、12周末IL-1β、5-HT比較，差異有統計學意義（p＜0.05）。第8、12周末，模型組、玻璃酸鈉組、手法組IL-1β、5-HT高于空白組，差異有統計學意義（p＜0.05）；第8、12周末玻璃酸鈉組、手法組IL-1β、5-HT低于模型組，差異有統計學意義（p＜0.05）；第8、12周末玻璃酸鈉組IL-1β、5-HT與手法組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。第8周末空白組、模型組IL-1β、5-HT與12周末比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；第8周末玻璃酸鈉組、手法組IL-1β、5-HT高于第12周末，差異有統計學意義（p＜0.05，見表5）。

3 討論

KOA是多種生物因素與機械損傷因素相互作用致生物力學紊亂而引起的病理改變，中老年人多發［7-9］。其中疼痛是KOA最突出、最常見的癥狀，因此，緩解疼痛也成為臨床需要首要解決的問題。

KOA在中醫學屬于痹癥范疇，其發病機制多為感受風寒濕之邪，痹阻筋骨［10］，或勞損外傷致氣滯血瘀、瘀阻脈絡，或年老久病、肝腎虧虛、筋脈失養而成，其位在膝，其本為注：與空白組比較，ap＜0.05；與模型組比較，bp＜0.05；與第8周末比較，cp＜0.05肝腎不足。《素問·五臟生成篇》曰：“諸筋者，皆屬于節。”《說文解字》釋曰：“筋者，肉之力也。”指出筋可產生力量，同時明確筋是肉性組織。《素問·痿論》篇曰:“宗筋主束骨而利機關也。”“傷筋而損骨”是KOA發病的關鍵環節，表明KOA發病并不單指在“骨”的疾病，“筋”為其重要病變部位，進一步表明在生理上、病理上筋骨密不可分，“筋”于“骨”具有束骨、利機關和保護關節3種功能，即“筋為骨用”。“舒筋”手法是指通過揉法、拿法、分筋、搓膝等手法松解膝關節周圍軟組織的攣縮、粘連、瘢痕，達到放松肌肉、消除痙攣的目的。“舒筋”手法能有效放松肢體，緩解疼痛，消除骨骼肌過度緊張和僵硬，保持肌肉的正常彈性，使關節內血液循環得以恢復，進而促進組織修復，恢復關節的力學平衡及正常的膝關節負重力線，緩解關節退變，達到“筋柔骨正”和以筋為主治療KOA的目的。

表 3 4組關節軟骨大體評分比較（，分）Table 3 Comparison of the gross score of articular cartilage erosion at the end of 8th and 12th weeks of intervention between the blank group and 3 subgroups

表 3 4組關節軟骨大體評分比較（，分）Table 3 Comparison of the gross score of articular cartilage erosion at the end of 8th and 12th weeks of intervention between the blank group and 3 subgroups

注：與空白組比較，ap＜0.05；與模型組比較，bp＜0.05；與第8周末比較，cp＜0.05

空白組 6 0.17±0.41 0模型組 6 3.17±0.75a 3.00±0.89a玻璃酸鈉組 6 2.00±0.63ab 1.67±0.75abc手法組 6 2.17±0.75ab 1.00±0.63abc F值 9.375 21.226 P值 ＜0.001 ＜0.001

，分）Table 4 Comparison of the Mankin score measured at the end of 8th and 12th weeks of intervention between the blank group and 3 subgroups表 4 4組Mankin's評分比較（

，分）Table 4 Comparison of the Mankin score measured at the end of 8th and 12th weeks of intervention between the blank group and 3 subgroups表 4 4組Mankin's評分比較（

空白組 6 0.17±0.41 0.17±0.41模型組 6 8.67±1.21a 7.83±0.98a玻璃酸鈉組 6 4.83±0.98ab 2.33±1.03abc手法組 6 4.17±1.17ab 2.33±1.03abc F值 73.319 78.776 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖 1 第8周末光鏡下關節軟骨組織學形態（HE染色，×200）Figure 1 Light microscopy of the histological structure of articular cartilage of the blank group and 3 subgroups at the end of the 8th week of intervention

圖 2 第12周末光鏡下關節組織學形態（HE染色，×200）Figure 2 Light microscopy of the histological structure of articular cartilage of the blank group and 3 subgroups at the end of the 12th week of intervention

在組織病理學上，第8周末和第12周末玻璃酸鈉組、手法組Lequesne MG評分低于模型組，表明兩者對KOA的軟骨修復均起到一定的作用；第8周末玻璃酸鈉組和手法組Lequesne MG評分與第12周末比較有差異，并且軟骨細胞排列較整齊，接近空白組；第8周末和第12周末，玻璃酸鈉和手法組Lequesne MG評分無差異，表明兩者療效近似。

IL-1是最經典的炎癥調節劑，是調節炎癥的始動因素，其由巨噬細胞、軟骨細胞、滑膜細胞等多種細胞產生，有IL-1α和IL-1β 2種亞型。早在上個世紀的70年代就有研究發現，體外培養巨噬細胞時其上清液能促進軟骨的降解，并促進軟骨細胞分泌金屬蛋白酶，而其上清液以IL-1α、IL-1β為主，能促進軟骨和滑膜組織金屬蛋白酶的表達［11-12］，包括基質溶酶、膠原酶、組織纖維蛋白溶酶激活劑等，并輔助B細胞生長、誘導內皮細胞黏附因子的表達，抑制軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA的表達［13］、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成［14］，具有骨吸收作用［15-16］。外周5-HT是體內一種重要的吲哚型生物活性胺［17］，主要在胃腸黏膜的嗜鉻細胞（EC）或APUD細胞中生成［18］，釋放入血后由血小板吸附、貯存和運載，在創傷和炎癥情況下，血小板釋放出5-HT，成為一種重要的炎性遞質。所以通過檢測IL-1β和5-HT可以提示關節炎癥的程度。本研究結果顯示，第8、12周末，模型組、玻璃酸鈉組、手法組IL-1β、5-HT高于空白組，玻璃酸鈉組、手法組IL-1β、5-HT低于模型組；初步證實了“舒筋”手法可延緩膝關節軟骨退變，減少炎性因子IL-1β、5-HT釋放，表明“舒筋”手法具有改善膝關節功能、緩解膝關節疼痛、減少膝關節軟骨的破壞、促進膝關節軟骨修復的效果，為基于“筋為骨用”的“舒筋”手法的進一步臨床推廣應用提供了實驗依據。

作者貢獻：吳佳航進行文獻/資料收集、整理，撰寫論文；張弛進行文章的構思與設計，文章的可行性分析，文章的質量及審校，監督管理；董思佳負責文獻/資料整理、英文翻譯；尹浩負責統計學分析。

本文無利益沖突。

表 5 4組關節液中白介素1β、5-羥色胺比較（x ±s）Table 5 Comparison of the expression levels of IL-1β and 5-HT in the joint fluid at the end of 8th and 12th weeks of intervention between the blank group and 3 subgroups

本文不足：

本研究在“舒筋”手法操作上尚缺少可量化的指標；對推拿手法的量效關系上，尚未有深入研究。今后將在充分應用現代科學技術和科技成果的基礎上，多學科、多層次、多角度進行研究，從而為預防和治療膝關節骨性關節炎提供新的思路。

［1］余曙光，郭光.實驗針灸學［M］.上海：上海科技出版社，2009：152-153.

［2］中國畜牧獸醫學會.中國獸醫針灸學［M］.北京：農業出版社，1984：214-215.

［3］胡元亮，華興邦.兔針灸穴位的研究［J］.實驗家兔與家兔實驗，1993，4（1）：20-25.HU Y L，HUA X B.Research on rabbit acupuncture points［J］.Laboratory Animal and Animal Experiment，1993，4（1）：20-25.

［4］LEQUESNE M G，SAMSONS M.Indices of severity in osteoarthritis for weight bearing joints［J］.J Rheumatol Suppl，1991，27：16-18.

［5］PELLERIER J P，JOVANOVIC D，FEMANDES J C，et al.Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase［J］.Arthritis Rheum，1998，41（7）： 1275-1286.

［6］HAYAMI T，PICKARSKI M，ZHUO Y，et al.Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis［J］.Bone，2006，38（2）：234-243.DOI：10.1016/j.bone.2005.08.007.

［7］DAVIS A M，PALAGANAS M，LI L C.Public opinion on community-based education and exercise programs formanaging hi p and knee osteoarthritis-like symptoms：results of a survey［J］.Patient Prefer Adherence，2016，10：283-290. DOI：10.2147/PPA.S101717.

［8］陳慶奇，龔敬樂.基于國內外指南的適用于我國全科醫療的膝骨關節炎診治流程［J］.中國全科醫學，2016，19（2）：125-129.CHEN Q Q，GONG J L.Diagnosis and treatment process of knee osteoarthritis applicable in the general practice of china based on domestic and abroad guidelines［J］.Chinese General Practice，2016，19（2）：125-129.

［9］寧衛權，譚進，彭水姣，等.分度流程化保守治療對中重度膝骨性關節炎關節功能的影響研究［J］.中國全科醫學，2015，18（29）：3574-3578.NING W Q，TAN J，PENG S J，et al.Effect of graded and processized conservative treatment on the joint function of patients with moderate and severe knee osteoarthritis［J］.Chinese General Practice，2015，18（29）：3574-3578.

［10］楊志偉，張弛.何洪陽教授治療膝關節骨關節炎經驗［J］.四川中醫，2017，32（3）：38-39.DOI：1000-3649（2014）03-0038-02.

［11］CHEN W P，XIONG Y，HU P F，et al.Baicalein inhibits MMPs expression via a MAPK-dependment mechanism in chondrocytes［J］. Cell Physiol Biochem，2015，36（1）：325-333.DOI：10.1159/000374075.

［12］馮欣，李垚.STAT 1對白介素1β誘導的關節軟骨細胞衰老的影響及其可能機制研究［J］.中國全科醫學，2016，19（11）：1310-1313.FENG X，LI Y.Influence of STAT-1 on articular cartilage cells senescence induced by IL-1β and the possible mechanism［J］.Chinese General Practice，2016，19（11）：1310-1313.

［13］葉雨辰，張長春，朱坤，等.蜂毒肽對IL-1β誘導的大鼠腰椎終板軟骨細胞Ⅱ型膠原表達的影響研究［J］.中國修復重建 外 科 雜 志，2017，31（3）：345-350.DOI：10.7507/1002-1892.201609062.YE Y C，ZHANG C C，ZHU K，et al. Effect of Melittin on collagen type Ⅱ expression of rat endplate chondrocytes induced by interleukin 1β［J］.Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery，2017，31（3）：345-350.DOI：10.7507/1002-1892.201609062.

［14］馮雍，鄒季.獨活寄生湯對兔膝骨性關節炎關節液中白介素-1β、腫瘤壞死因子-α和Ⅱ型膠原的影響［J］.湖北中醫藥大學學報，2017，19（1）：15-18.DOI：10.3969/j.issn.1008-987x.2017.01.04.FENG Y，ZOU J. Effects of Duhuojisheng decoction on the expression of IL-1β，TNF and Collagen Ⅱ of synovial fluid in rabbits with osteoarthritis［J］.Journal of Hubei University of Chinese Medicine，2017，19（1）：15-18.DOI：10.3969/j.issn.1008-987x.2017.01.04.

［15］YI J W，LEE W S，KIM S B，et al.Effect of zoledronate on the expression of vascular endothelial growth factor-a by articular chondrocytes and synovial cells： an in vitro study［J］.J Bone Metab，2014，21（4）： 249-255.DOI：10.11005/jbm.2014.21.4.249.

［16］KAMEDA Y，TAKAHATA M，MIKUNI S，et al.Siglec-15 is a potential therapeutic target for postmenopausal osteoporosis［J］.Bone，2015，71：217-226.DOI：10.1016/j.bone.2014.10.027.

［17］史學義，吳景蘭.外周5-羥色胺系統與針刺鎮痛［J］.針刺研究，1983，8（2）：146.

［18］周舒，婁艾琳.5-羥色胺的生理和病理生理［M］.北京：人民衛生出版社，1988：77.ZHOU S，LOU A L.The physiology and pathophysiology of 5-hydroxytryptamine［M］.Beijing：People's Medical Publishing House，1988：77.