外泌體作為浸潤性乳腺癌診斷標志物的研究進展

鐘國斌，韋 薇，周 曉，朱玲鈺，梅 燕 綜述，劉劍侖 審校

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科，南寧 530021)

浸潤性乳腺癌是指癌細胞已穿破乳腺導管或小葉腺泡的基底膜并侵入間質的一種惡性腫瘤，是乳腺癌中最常見的類型。乳腺癌目前診斷的金標準是病理檢查，其缺點是給患者帶來創傷。外泌體是細胞主動分泌的、內含生物活性分子的囊泡小體，其本質是脂質雙分子層。由于外泌體的特性，外泌體作為浸潤性乳腺癌的早期診斷標志物具有巨大的潛力。

1 外泌體概念

外泌體最早是在體外培養的綿羊紅細胞的上清液中被發現。1987年JOHNSTONE等[1]對網織紅細胞培養液分離純化后得到了一種納米級囊泡樣物質，并將其命名為外泌體(exosomes)。外泌體是細胞主動分泌的，大小均一，直徑為30～100 nm，密度是1.10～1.18 g/mL的囊泡小體,其本質是脂質雙分子層[2]。電鏡下觀察外泌體其形狀呈杯狀結構。外泌體可有樹突細胞、血小板、淋巴細胞、內皮細胞、肥大細胞、間充質干細胞、成纖維細胞和腫瘤細胞等不同細胞種類脫落釋放。在大多數體液中如外周血、唾液、尿液、腦脊液、關節液、精液、羊水、腹水等體液中可檢測到外泌體。與同源組織器官類型的正常細胞和正常體液相比,腫瘤細胞能分泌更多的外泌體,癌性體液能包含更多的外泌體[3-5]。

不同細胞來源的外泌體,其內容物也有所不同,但都富含生物活性分子,如核酸、蛋白質、脂質。外泌體所攜帶的內容物作用于靶細胞，使細胞間的通信得以進行，最終實現調節靶細胞基因表達和細胞功能。研究表明，外泌體能攜帶腫瘤遺傳信息，影響腫瘤微環境的形成，促進腫瘤血管生成，增強腫瘤細胞侵襲和轉移能力，介導腫瘤免疫抑制及參與腫瘤放化療抵抗，進而促進腫瘤的發生、發展[6]。根據其生物學特征，外泌體能在體液中被檢測到，檢測體液中外泌體的水平及其所含的miRNAs和DNA可以反映腫瘤進展和治療預后，可作為一種新的癌癥診斷標志物，在疾病診斷和臨床方面中有較好的應用前景。

迄今為止，在PubMed網站上發現了超過6 000篇關于“exosome”的論文，其中大部分是在近5年內發表。這表明學者對外泌體作為疾病的研究對象越來越感興趣，特別是在腫瘤領域中其更是成為了研究熱點。美國2018年最新癌癥統計報告中，乳腺癌占女性新發癌癥病例的30%，遠超其他癌癥所占比例[7-8]。在中國國家癌癥中心近日發布的我國癌癥負擔最新結果，乳腺癌也居于女性癌癥發病率首位。由于乳腺癌已成為我國常見的惡性腫瘤之一，且上升趨勢、年輕化趨勢明顯，嚴重危害廣大女性同胞身心健康，除了加大乳腺癌的科普宣傳，尋找乳腺癌生物標志物用于疾病早期診斷顯得迫在眉睫。

外泌體是一類納米級模性囊泡，成功地對各類樣品中分離并鑒定外泌體，對不斷揭示外泌體功能、對人類加深機體生理病理等過程至關重要。目前對分離外泌體的技術主要有離心法(最常見)、沉淀法、超濾法、免疫親和法、微流控技術等；基于外泌體的特征，可對外泌體進行鑒定，主要的鑒定技術是：電子顯微鏡檢測、粒徑及濃度檢測、Western blot法、流式細胞術。因外泌體特有的結構和性能，許多激動人心的外泌體分離技術仍在積極的探索中，如電滲法、微流控、免疫親和捕捉后洗脫。然而，到目前為止，尚未有一種技術可以實現大家公認的外泌體高純度、高回收率富集。

根據外泌體數據庫Exocarta(http://www.exocarta.org)最新的數據顯示，不同組織細胞所產生的外泌體中含有9 769種蛋白質，3 408種RNA，2 838種miRNA及1 116種脂類物質。外泌體內含的蛋白質主要包括兩類：(1)在外泌體中普遍存在的蛋白，如熱休克蛋白(HSP60、HSP70及HSP90)、4次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、ALG-2相互作用蛋白X(Alix)、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)；(2)蛋白則是與外泌體親代來源細胞有關，如轉化生長因子(TGF)β1和MAGE3/6特異存在卵巢腫瘤細胞外泌體中[9]。表皮生長因子受體(EGFR)特異存在于非小細胞性肺癌中[10-11]。各種蛋白分子為外泌體在抗原遞呈和共刺激的過程中發揮作用奠定了基礎。外泌體中的核酸來源于親代細胞，包括雙鏈和單鏈DNAM，線粒體DNA，RNA如信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、非編碼RNA(ncRNA)，以及核糖體RNA。外泌體富含二酰甘油、膽固醇、磷脂、鞘脂和磷脂酰絲氨酸等脂質，外泌體中的脂質成分的比例與其細胞來源有關，但目前對外泌體脂質的研究報道并不多。

2 精準醫療與液體活檢

自美國原總統貝拉克·侯賽因·奧巴馬(Barack Hussein Obama)于2015年1月提出“精準醫療計劃”，這一計劃迅速影響了全世界的醫療發展，且分子生物學和臨床醫學教授們對精準醫學賦予了科學的解釋。精準醫療(precision medicine) 是以個體化醫療為基礎、隨著基因組測序技術快速進步及生物信息與大數據科學的交叉應用而發展起來的新型醫學概念與醫療模式。其本質是通過基因組、蛋白質組等組學技術和醫學前沿技術，對大樣本人群與特定疾病類型進行生物標志物的分析與鑒定、驗證與應用，從而精確找到疾病的原因和治療的靶點，并對一種疾病 的不同狀態和過程進行精準分類，最終實現對疾病和特定患者進行個性化精準治療的目的，以提高疾病診治與預防的效益。

在精準醫學的大背景下，液體活檢(liquid biopsy)作為一種便捷、微創、能夠動態反映腫瘤基因譜全貌的方法在臨床研究與實踐中發揮著越來越重要的作用。用于液體活檢相應的多種檢測技術也發展迅速。液體活檢與傳統組織活檢金標準相比，具有明顯的優勢：(1)對受檢者的創傷小，對患者而言可接受性高。(2)液體活檢可縮短癌癥診斷時間,可以反映出腫瘤的基因組全貌[12-13]。(3)與其他無創診斷手段相比，液體活檢對癌細胞的診斷具有更高的靈敏度和特異度。(4)液體活檢還具有實時檢測、可重復性等優點。液體活檢包括循環腫瘤細胞(circulation tumor cell,CTC)、循環腫瘤循環腫瘤DNA(circulation tumor DNA,ctDNA)、外泌體和腫瘤血小板(tumor-educated platelets,TEPs),在癌癥領域應用廣泛，在診斷、治療和預后等方面具有很好的應用前景。外泌體為何能在腫瘤領域中成為研究熱點，是由以下特性決定的：(1)腫瘤細胞釋放的具有生物活性的外泌體在體液中的水平高，可達109/mL,因此靈敏度較高[14]。(2)外泌體選擇性攜帶其親代細胞的生物活性物質，如miRNA，這使外泌體更具有特異度[15]。(3)外泌體體積較小，可穿透體內各種組織屏障，容易傳送到各種體液中，為液體活檢提供了重要的前提條件[16]。(4)外泌體的脂質雙膜結構對其內容物起到很好的保護作用，可防止內容物被血液中酶類物降解，同時在體外也能保存一段時間，具有一定的穩定性。MENG等[17]用Taq Man miRNA、實時定量熒光聚合酶鏈反應和酶聯免疫吸附試驗等方法說明了miR-373、miR-200a、miR-200b、miR-200c這4種核酸對上皮卵巢癌有一定的診斷價值。ZHU等[18]證實了結直腸癌患者血清樣品中的外泌體miRNA-19a-3P、miRNA-21-5p和miRNA-425-5P的水平顯著升高。BRYANT等[19]運用實時聚合酶鏈反應分析發現前列腺癌患者血清外泌體中的miR-107和miR-574-3p的水平與正常人相比存在顯著差異。MADHAVAN等[20]通過檢測胰腺癌患者血清外泌體中miRNAs表達水平，結果顯示miR-1246、miR-4644、miR-3976和miR-4306可能作為檢測胰腺癌患者的診斷標志物。對肝癌患者血清和細胞上清液的外泌體中循環RNA進行分析，發現肝癌患者外泌體分泌的miR-519d、miR-21、miR-221、miR-1228與正常人相比差異均具有統計學意義，據此繪制的ROC曲線靈敏度高于甲胎蛋白，可以成為肝癌特異性的外泌體標志物[21-22]。LI等[23]發現腫瘤患者外泌體所攜帶的環狀RNA(circRNAs)的表達譜與健康人存在差異，得出可以通過檢測血清中circRNAs的表達水平以區分癌癥患者和健康人。

3 外泌體在浸潤性乳腺癌中的診斷價值

浸潤性乳腺癌是指癌細胞已穿破乳腺導管或小葉腺泡的基底膜并侵入間質的一種惡性腫瘤。既往認為腫瘤的發生是源于具有自我更新能力的腫瘤干細胞，且這類細胞可以促進腫瘤的進一步發展[24]。

然而近年來研究發現,外泌體在乳腺癌的發生過程中也起了重要的作用。LIU等[25]發現，乳腺癌細胞分泌的外泌體(Exo-BCa)可以選擇性減少穿膜蛋白的表達，抑制NK細胞的活性及阻礙JAK-3和cyclin D3的表達，從而抑制細胞的增值。DUTTA等[26]證實，Exo-BCa能夠與正常乳腺上皮細胞相互作用且產生活性氧,進而誘導磷酸化P53、細胞自噬、DNA損傷應答，使正常的乳腺細胞增殖。CHO等[27]發現Exo-BCa使脂肪組織中的間充質干細胞通過Smad通路轉變為肌成纖維細胞。后者可以參與腫瘤血管的重建，是腫瘤細胞轉移的重要因素之一。外泌體中miR-210進入血管內皮細胞，作用于靶基因絡氨酸蛋白激酶A3，可活化內皮細胞誘導血管生成因子，進而促進血管生成[28]。Exo-BCa中半乳糖凝集素3和膜表面脂質筏微型域粘合斑處的膜聯蛋白結合，固定在其細胞表面，實現后續的傳播和黏附[29]。黏附不僅是在各種病理條件下相當重要，在腫瘤生物體中也極為重要。在乳腺癌細胞中，細胞脫離與外泌體的顯著釋放有關，外泌體聚集在細胞表面，介導細胞與細胞外基質蛋白的黏附[30]。胎牛血清中的甲胎蛋白A已被證實為細胞黏附的重要線索[31]。甲胎蛋白A通過募集外泌體介導癌細胞黏附，這些外泌體也參與了轉移位點的制備，調節細胞生長和活力。許多研究發現外泌體可以改變靶細胞的轉錄，并有助于致癌轉化和腫瘤形成[32-33]。例如，乳腺癌細胞分泌的外泌體(MDA-MB-231)能夠將正常的人類乳腺上皮細胞(MCF-10)轉化為癌細胞。在細胞培養和小鼠模型中，這些癌外泌體包含的miRNAs改變了受體細胞的轉錄組，并誘導了沉默復合物、負載復合蛋白、加工前miRNA、TAR RNA結合蛋白2和Argonaute-2進入成熟的miRNAs，且在局部發揮促進腫瘤形成和增殖作用，還可以影響遠處的細胞[34]。

循環外泌體包裹的miRNAs是乳腺癌早期理想的生物標志物，外泌體miRNAs的表達模式也與腫瘤的惡性程度和預后有關[35]。ZHOU等[36]通過對乳腺癌細胞株MDA-MB-231和正常乳腺上皮細胞MCF 10A外泌體中所有的小RNAs進行高通量測序和對比，發現MDA-MB-231外泌體中的miR-105表達水平明顯升高。外泌體miR-939在基底樣腫瘤亞型中高度表達，與三陰性乳腺癌預后差有關[37]。外泌體miR-101濃度降低與乳腺癌淋巴結陽性有關，三陰性或雌激素受體、孕激素受體陰性乳腺癌患者的miR-373水平顯著上調。而且KHAN等[38]收集了40例乳腺癌患者血液樣本進行外泌體及其內容物的檢測，發現外泌體源性的survivin-2B 在疾病早期高表達。乳腺癌細胞產生的外泌體可以檢測到過表達的蛋白標志物，如腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體、Fas配體和TGF等腫瘤抗原抑制蛋白[39]。KHAN等[40]研究表明survivin及其剪切變異體在乳腺癌組織中差異性表達，在乳腺癌細胞凋亡中有不同的作用。他們認為是乳腺癌細胞釋放了外泌體中的survivin。進一步研究發現，乳腺癌患者血清中survivin-2b的表達分析可以作為乳腺癌早期診斷和預后的標志物[38]。

4 展 望

綜上所述，外泌體可能參與了乳腺癌的發生、發展，檢測外泌體及其內容物可能是診斷乳腺癌的新思路。外泌體作為浸潤性乳腺癌診斷標志物是有前景的，對于乳腺癌的早期診斷具有重要作用。然而，截至目前，外泌體在浸潤性乳腺癌發生、發展的各種機制尚未完全清楚，外泌體的富集效率仍比較低。目前對外泌體的研究的樣本例數仍比較少，想應用外泌體在浸潤性乳腺癌作為診斷標志物仍需要進一步的深入研究。