白血病與血管生成擬態

劉坤梅，申政磊 綜述，曾 云△ 審校

(1.昆明醫科大學第一附屬醫院/云南省血液病研究中心，昆明 650032； 2.昆明醫科大學第三附屬醫院血液科，昆明 650100)

目前研究顯示，腫瘤細胞獲取氧氣通過以下3個途徑：(1)經典的腫瘤細胞供血途徑，血管內皮的變化基本與缺氧息息相關。(2)腫瘤細胞為克服自身缺氧而發生的適應性改變——血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM)。(3)介于二者之間的機制，包括馬賽克血管生成，血管生成共選擇等。其中VM理論近年來受到學者關注，現研究證明其對傳統腫瘤血管生成理論的一個重要補充，不僅解釋了經典血管生成理論難以解釋的一些問題，也為解決抗腫瘤血管新生療效不佳進而尋找新的抑制腫瘤血管治療提供了思路。 目前，針對白血病與VM的文獻還較少。本課題組從2014年對白血病中與VM相關問題進行探討，現就白血病與VM的研究進展綜述如下。

1 VM概述

1999年MANIOTIS等[1]在對人眼葡萄膜黑色素瘤微循環的研究中發現惡性黑色素瘤細胞通過自身變形并與細胞外基質(EMC)相互作用，形成一種可輸送血液的管道、可模擬血管壁結構的系統，從而重塑腫瘤的微循環，這些形成的系統可與宿主血管相連通，并使腫瘤獲得血液供應，此現象被命名為 VM ，進而提出一種不依賴機體內皮細胞襯覆的腫瘤血供模式。VM的提出對以內皮依賴性血管是腫瘤微循環惟一方式的傳統觀念提出了挑戰，同時也是研究腫瘤相關血管生成的重要補充。目前在惡性黑色素瘤、上皮樣肉瘤及腺泡型橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、胸膜間皮肉瘤、炎性乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌、肝癌等中都發現存在VM[2-6]。其特征是：(1)血管壁主要由腫瘤細胞構成；(2)血管腔內層不是由內皮細胞構成，而是一層過碘酸雪夫反應(PAS)染色呈陽性基底膜樣結構；(3)內皮特異標記的免疫組織化學檢測[凝血因子Ⅷ(FⅧ)、CD31、CD34、KDR和荊豆素(Ulex)等]呈陰性反應；(4)腫瘤干細胞(CSC)可能參與了VM的形成。與VM的發生及調控相關的因素包括缺氧、遷移誘導蛋白(Mig-7)、蛋白激酶受體A2(EphA2)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、環磷酸腺苷(cAMP)等。

VM的價值在于其與腫瘤的惡性程度、腫瘤的級別、侵襲性、分期及CSC等緊緊聯系在一起。MANIOTIS等[1]發現無論是普通的黑色素瘤細胞或者是低侵襲性的黑色素瘤細胞，在設置相同的體外環境中都不會形成侵襲性黑色素瘤細胞所形成的VM網絡結構，而高侵襲性的黑色素瘤細胞在體外環境中則可形成。一些在肝細胞癌、平滑肌肉瘤、胃腸道間質瘤等腫瘤中多有相似的結論。在研究惡性膠質瘤中，發現VM的形成過程與CSC有著密切聯系。國內學者檢測了肝癌干細胞標志物CD133和CD34在肝癌VM形成中的表達，發現腫瘤細胞可以通過自身變形形成VM，并且在形成VM的癌細胞表達CD133和CD34高于未形成VM的細胞[7]，作者認為此發現間接說明了在形成VM的肝癌細胞中，CSC高表達。可以看到，VM涉及的細胞包括腫瘤細胞、內皮細胞、CSC、間質細胞等。

2 白血病與VM

目前，在白血病中有關VM的研究極少，原因是：(1)白血病是全身彌漫性腫瘤，主要累及骨髓、外周血等血液循環豐富的部位，髓外形成包塊、病灶的情況相對較小。(2)白血病細胞為懸浮細胞，其寄生在血液中，分布相對較廣，缺氧的概率遠遠小于局限生長的實體瘤細胞。(3)“種子和土壤”假說在血液疾病發展、研究中一直占據經典地位，這些年研究中心和方向始終放在種子上；而對土壤的研究和相關報道嚴重不足[8-10]。(4)白血病種類多、分型復雜、細胞個體差異大，想要在繁多的白血病類型中尋找共同的特征難度大。(5)白血病是干/祖細胞疾病，大家廣泛認同腫瘤細胞遺傳、細胞表型、細胞類別等方面特征決定其轉移能力，而腫瘤特異轉移器官的微環境對于腫瘤擴散的影響認識不足。(6)白血病細胞模型構建、三維培養、共培養體系難度大。

2.1骨髓等活檢標本中存在VM樣結構的可能性 眾所周知，骨髓活檢標本中與VM相關的結構主要包括基質結構(間質和PAS樣物質)、微血管密度(MVD)、幼稚前體細胞異常定位(ALIP)和前ALIP，CD133+的細胞(包括CD133+的白血病細胞、內皮祖細胞)等[11]。本課題組前期研究發現，在急性早幼粒細胞白血病(APL)及其他急性白血病(AL)患者骨髓組織中，可以發現經典內皮血管的MVD明顯增加[12]，這與目前主流觀點認為腫瘤細胞促進血管生成相一致。目前，針對VM的研究主要集中在實體腫瘤(包括黑色素瘤，乳腺癌，膠質瘤等)，活檢標本中基本采用CD133+細胞來驗證VM結構，認為CD133+的腫瘤細胞是形成VM的關鍵成分，進而將其與CSC聯系起來，認為CSC參與了VM的形成，并認為這是造成惡性腫瘤難以治療的因素之一。骨髓內CD133+的細胞包括CD133+的白血病細胞和內皮祖細胞(EPO)，有研究觀察了CD133+細胞在骨髓標本中的表達，分析比對CD133+的白血病細胞和EPO的表達情況，發現在AL骨髓中CD133陽性表達主要在白血病細胞上(80%)；而表達CD133的EPC細胞也明顯增多，尤其是在慢性粒細胞白血病(CML)中[13]；但最為關鍵的是這種表達在免疫組織化學切片中無法區分是VM還是經典血管通路，因為AL細胞基本以彌漫性分布，即便是靠近骨小梁的位置，也很少有局限性的病灶出現。ALIP認為是由白血病前體細胞組成的，是白血病復發進展的根源，某種程度上相當于白血病細胞niche，該類細胞間的微循環關系理論上應該與VM相關。有研究對AL緩解標本中ALIP結構中細胞之間及細胞周圍進行觀察，未發現PAS染色陽性的微血管結構。目前在活檢標本中發現與VM樣結構最接近的是2014年COGLE等[6]通過NSG小鼠動物模型和30例急性粒細胞白血病(AML)患者尸體肝組織中出現了白血病細胞浸潤；并利用種屬特異性抗體，鑒定出一組與門靜脈內皮細胞相關的白血病細胞，作者把它們命名為血管組織相關的白血病細胞(vascular tissue-associated AML cells，V-AML)，其表型主要為mCD31+hCD45+，約占全部門靜脈內皮細胞的2%，更為重要的是通過mCD31+免疫磁珠分選AML小鼠肝組織中V-AML細胞，發現96%含有FLT3-ITD融合基因，從而提示AML的來源。通過FISH發現V-AML細胞與內皮細胞間存在一定的核型融合(0～1%)；通過比對AML細胞，發現V-AML細胞穩定表達CD105抗原(一種反映內皮功能活化及血管新生的標記)，該類V-AML細胞的增殖活性較noV-AML細胞強4倍以上，提示V-AML細胞在AML病情變化中有重要作用。但該類細胞僅僅只是與內皮相關，自身并未形成管腔樣結構，只是黏附于形成血管的內皮細胞附近，故不是VM樣結構[14]。綜上所述，作者認為在AL骨髓組織中存在VM樣結構可能性很小。

2.2VM本質上是腫瘤細胞內皮轉化 目前研究顯示，在實體瘤中形成VM的細胞主要是CD133+的腫瘤細胞，這些細胞的來源有以下可能：(1)從腫瘤細胞的產生/表達角度來看，相關文獻顯示腫瘤細胞產生高表達MMP類物質，MMP活化后可促進EMC中的成分層黏連蛋白5γ2(Laminin-5γ2)水解成片段,這些片段沉積于腫瘤外環境中為VM形成提供空間結構；腫瘤細胞出現多潛能胚胎細胞表型,或出現多種與內皮細胞表型有關的基因表型可能是VM模擬血管變形的重要分子基礎。腫瘤細胞分泌細胞黏附分子促進VM管壁形成；同時腫瘤細胞在生長過程中還分泌一些EMC(PAS陽性物質、Ⅳ膠原)參與構成VM的基底膜樣結構;腫瘤細胞之間的黏附是VM形成的必要條件,其中EphA2與VE-cadherin二者共同聚集在細胞與細胞之間的黏附點,促進了構成VM周圍腫瘤細胞彼此之間的黏附[15-17]。(2)從CSC角度來看，研究顯示CSCs能分化為腫瘤間質細胞等非腫瘤細胞，同時也可分化為異質性的子代腫瘤細胞，這種轉分化能力對于腫瘤組織中非宿主血管內皮來源的腫瘤血管新生具有重要作用。這種轉分化能力不但具有普遍性，而且具有異質性。有學者在CD133+膠質母細胞瘤細胞、乳腺癌、卵巢癌、腎癌研究均表明CSCs在特定條件下可能轉分化為腫瘤來源的內皮細胞；而在膠質瘤中發現并不是所有的CSCs都能夠轉分化為血管內皮細胞，在膠質母細胞瘤中將CSCs分為CD133+/CD144-、CD133+/CD144+、CD133-/CD144+和CD133-/CD144-4個亞群，其中CD133+/CD144+只能轉分化為EPC再進一步分化為成熟的內皮細胞，而CD133+/CD144-細胞亞群能夠轉分化為腫瘤來源性內皮細胞[18]。在缺氧的三維培養中，神經膠質瘤干細胞明顯表達內皮細胞標志CD31、CD34、KDR和vWF，分化成血管內皮樣細胞并形成管樣結構[19]。體外培養的成膠質細胞瘤干細胞，部分能分化成平滑肌樣細胞，形成血管樣結構，并表達內皮相關基因包括E-phA2、Neuropilin-239和Laminin52[20]。上述研究顯示，CD133+細胞是VM形成主要細胞。可能答案是CD133+是EPC分化為內皮細胞過程中最主要的影響因素，是EPC最主要的特征；無論是腫瘤細胞或CSC，形成VM樣的前提條件是發生可塑性的內皮分化，CD133表達的增強正是內皮分化的直接體現。

2.3白血病細胞中是否存在VM的細胞 缺氧是形成VM最根本因素，因為VM正是腫瘤細胞為克服缺氧環境而主動塑造的一種供血通道。針對白血病細胞形成VM樣結構的根本原因是供氧不足，因為白血病細胞彌散分布在血液中，顯然這種概率較實體瘤而言相對較低。有研究探討骨髓間充質干細胞(BMSCs)在形成MVD時，對比分析了13例AL及23例達到CR的骨髓標本，發現AL來源的BMSCs分泌更多的基質細胞衍生因子1α(SDF-1α)與胰島素生長因子-1(IGF-1)；AL來源的CD133+/CD34+BMSCs能形成VM，這種能力通過PI3/r-GTP激酶途徑起作用，如果阻斷該途徑就可抑制VM形成。研究發現CSC有EPC作用，可分化成內皮樣細胞，能夠自我更新、分化和無限增殖，進而形成管腔樣結構來運輸營養物質[21-22]。

為尋找白血病細胞是否具備形成VM的能力，有研究從所有可能表達CD133的細胞進行三維培養，發現CD133+和CD133-的白血病細胞、CD34+/CD38-和CD34+/CD38+白血病干細胞、CD33+PML/RARα+的APL細胞均不具備形成VM樣結構的能力，而EC、CD133+/CD34+BMSCs、EPC可以形成管腔樣結構[23]。那么是不是白血病中不存在這種類型的細胞呢？有研究通過在EPC培養環境中培養AML細胞發現白血病細胞本身所具有的造血細胞表型出現下降，而內皮樣表型逐漸增強，進而產生表型為CD45neg、CD105+acLDL+VEGFR2+UEA1+的內皮樣細胞，作者把該類細胞命名為白血病衍生的內皮克隆單位形成細胞(leukemia-derived endothelial colony-forming cells，L-ECFC)。與正常內皮細胞和EPC比較，L-ECFC在Matrigel膠三維培養中更容易形成管腔樣結構，CD14、CD115等髓系標志和全髓標志CD45降低，而CD105,UEA-1、CD146和VEGFR2等標志增強[24-25]；作者比對了肝組織中V-AML、L-ECFC、noV-AM 3種細胞的致白血病效應，發現(3～10)×103mCD31+V-AML細胞、3×104noV-AML細胞不會導致NSG小鼠發生白血病；而當把一定數量的L-ECFC回輸白血病NSG小鼠體內后，其又會恢復為白血病表型，進而引發白血病的發生。由此可知，白血病中也存在類似VM機制的變化，不同之處在于沒有實體腫瘤那么明顯，而是隱藏在調控白血病細胞生長的niche中。

綜上所述，本研究認為VM某種程度上是腫瘤細胞為克服缺氧而適應其周圍環境產生變化的一種表現形式，其本質與腫瘤細胞可塑性內皮分化密切相關，深入探討其本質對闡明白血病細胞的微環境niche具有重要意義。