結節性紅斑患者皮損處CD4、CD8表達的變化及意義

陳麗莉，韓晨珠，王艷心，王 成，李保強△

（1.承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000；2.漯河市第二人民醫院皮膚科）

結節性紅斑(erythema nodosum，EN)是一種常見的炎癥性脂膜炎，以紅斑、炎癥性皮下結節為主要表現，該病病因復雜，確切的發病機制仍不清楚，病理變化主要以淋巴細胞浸潤為主。目前國內外多項研究表明，T淋巴細胞亞群分布異常與EN發病有關，而CD4+T淋巴細胞數量及功能失衡是T淋巴細胞免疫功能異常的重要表現[1-3]。本研究擬檢測EN患者皮損處CD4、CD8表達的變化，進一步探討EN的發病機理。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集承德醫學院附屬醫院皮膚科1984年9月-2014年6月經臨床及病理確診，并存檔的原發性EN患者皮損組織和正常皮膚組織蠟塊。疾病組49例患者中男4例、女45例，年齡6歲～60歲，平均（37.18±12.26）歲；正常組中10例正常皮膚組織，男3例、女7例，年齡20歲～65歲，平均（43.00±14.51）歲。

1.2 試劑來源 兔抗人CD4單克隆抗體（RMA-0620）、鼠抗人CD8單克隆抗體（MAB-0021）、即用型快捷型免疫組化MaxVisionTM試劑盒、羊抗鼠/兔（KIT-5010）二抗、DAB顯色試劑盒（DAB-0031），福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 免疫組化染色及結果判定

1.3.1 染色方法：采用MaxVisionTM免疫組織化學染色法檢測CD4和CD8的表達。組織置于4%甲醛中固定后常規石蠟包埋，切片厚度4μm；切片于80℃電熱恒溫箱烘烤3h，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；3%H2O2室溫孵育，抗原修復，一抗（工作濃度1：50）4℃過夜，二抗室溫孵育2小時，DAB顯色，蘇木素復染；1%鹽酸酒精分化，氨水返藍后封片。光鏡下觀片，雙盲法計數陽性細胞。CD4和CD8陽性著色為棕黃色顆粒，位于淋巴細胞的細胞膜、細胞漿。以PBS代替一抗作為空白對照，以已知陽性結果的組織切片作為陽性對照。

1.3.2 結果判斷：根據Fromowitz[4]的綜合計分法進行。在高倍鏡下（10×40）作如下評分：⑴陽性程度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；⑵陽性細胞百分率：5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞76%為4分。⑴+⑵判定最終結果：＜2分為陰性（-），2分～3分為弱陽性（+），4分～5分為中度陽性（++），6分～7分為強陽性（+++），以+及以上計為陽性。

1.3 統計分析 實驗數據采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，率的比較用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

疾病組CD4陽性率為100.00%，明顯高于對照組的70.00%，組間比較差異具有統計學意義（P＜0.01）。疾病組、對照組CD8陽性率分別為93.88%和90.00%，組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1-4，附表：

附表 疾病組皮損處和正常組皮膚組織CD4和CD8的表達情況

圖1 EN皮損組織CD4染色（×400）

圖2 正常皮膚組織CD4染色（×400）

圖3 EN皮損組織CD8染色（×400）

圖4 正常皮膚組織CD8染色（×400）

3 討論

根據細胞表面白細胞分化抗原決定簇的表達情況可將T細胞分為兩個亞群，即表達CD4的輔助T細胞(Th)和表達CD8的細胞毒性T細胞(CTL)，二者通常被作為判斷和確定T淋巴細胞亞群及成熟的標志。CD4分子為單鏈跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族(IgSF)成員，主要分布于T淋巴細胞，也分布于單核-巨噬細胞、胸腺細胞、B細胞的表面；CD8分子為二聚體結構，其雙鏈結構也屬于IgSF成員[3]。CD4+T細胞識別由MHC-Ⅱ類分子提呈的外源性抗原肽，作用是通過激活巨噬細胞產生和分泌多種細胞因子，引起以T淋巴細胞和單核-巨噬細胞浸潤為主的局部滲出性炎癥和免疫反應[5]。在炎癥反應中，活化的CD4+T細胞通過過度表達共刺激分子（CD40L）與單核細胞、內皮細胞、B細胞上的相應配體結合，從而誘導B細胞增殖、抗體形成及免疫球蛋白的分泌。CD8+T細胞通過識別由MH C-Ⅰ類分子提呈的內源性抗原肽發揮效應，主要是在某些細胞因子誘導下識別靶細胞，進而殺傷靶細胞，誘發免疫損傷，同時抑制體液免疫[6-7]。正常情況下，CD4+、CD8+T細胞數量或比值維持動態平衡，以保持機體正常的生理功能[3]。

有研究表明，T淋巴細胞亞群分布異常與多種血管炎性疾病的發生密切相關，而CD4+T細胞數量及功能失衡是導致T淋巴細胞免疫功能異常的重要因素[3]。EN做為一種以脂肪小葉間隔為主的脂膜炎，主要由Ⅳ型變態反應介導，55%以上為原發性，但也可以是系統疾病的皮膚表現，如系統性紅斑狼瘡、麻風、炎性腸病、結節病及腫瘤等[8]。Behcet’s病是一種自身免疫性疾病，可累及多個系統，而結節性紅斑也是此病的常見體征。Wang等[9-10]研究發現，Behcet’s病患者結節性紅斑皮損處有大量的T淋巴細胞浸潤，以CD4+T細胞浸潤為主；并且發現，Behcet’s病結節性紅斑中共刺激分子的大量表達促進了CD4+T細胞的活化、增生，從而導致了炎癥的發生和持續。本研究所有病例的結節性紅斑均為原發表現，且結果與上述研究發現類似，EN皮損處和正常皮膚組織均可見CD4和CD8的陽性表達，但疾病組CD4陽性表達率明顯高于正常組，說明EN皮損處也存在著以CD4+T淋巴細胞浸潤為主的免疫損傷；但疾病組和正常對照組CD8陽性表達率比較差異無統計學意義，考慮EN皮損的免疫損傷不以CD8+T淋巴細胞浸潤為主。

綜上所述，本研究顯示在EN患者皮損處存在著T淋巴細胞亞群的失衡，主要是與CD4+T細胞介導的免疫損傷有關，因此考慮CD4+T細胞在EN皮損的發病過程中起了重要作用。

【參考文獻】

[1]楊勤宇，李惠，趙恒光.結核相關結節性紅斑的研究進展[J].中國皮膚性病學雜志，2010，24(3)：280-282.

[2]Prezzemolo T,Guggino G,La Manna MP,et al.Functional Signatures of Human CD4 and CD8 T Cell Responses to Mycobacterium tuberculosis[J].Front Immunol,2014,5:180.

[3]Lintermans LL,Stegeman CA,Heeringa P,et al.T cells in vascular in fl ammatory diseases[J]. Front Immunol,2014,5:504.

[4]Fromowitz FB,Viola MV,Chao S,et al.Ras p21 expression in the progression of breast cancer [J].Hum Pathol,1987,18(12):1268-1275.

[5]Crispin JC, Liossis SN, Kis-Toth K, et al. Pathogenesis of human systemic lupus erythematosus: recent advances[J].Trends Mol Med,2010,16(2):47-57.

[6]Biancone L, Cantaluppi V, Camussi G. CD40-CD154 interaction in experimental and human disease (review)[J].Int J Mol Med,1999,3(4):343-353.

[7]McCarthy MK, Weinberg JB. The immunoproteasome and viral infection: a complex regulator of in fl ammation[J].Front Microbiol,2015,6:21.

[8]Schwartz RA, Nervi SJ.Erythema nodosum: a sign of systemic disease[J].Am Fam Physician,2007, 75(5): 695-700.

[9]王紅，楊培增，彭曉燕，等.共刺激分子在Behcet病患者結節紅斑組織中的表達[J].首都醫科大學學報，2005，26(3)：258-262.

[10]Wang H, Yang PZ, Peng XY, et al. An increased expression of CD40/CD40L costimulatory molecules in erythema nodosum of patients with Beh(c)et’s disease[J].Int J Ophthalmol,2007,7(4):883-886.