正交法優(yōu)化野生牛肝菌多糖的提取工藝*

肖艷紅，周曉慧，徐 倩，王 冉，趙春穎

（承德醫(yī)學院，河北承德 067000）

真菌多糖具有多種生理活性，如抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等[1-3]。從真菌中提取并篩選有活性的多糖一直是國內(nèi)外眾多領(lǐng)域研究和開發(fā)的熱點。牛肝菌[4]俗稱“大腳菇”，是一種稀有、名貴的野生食用真菌。根據(jù)文獻報道，牛肝菌多糖的提取方法較多。王浩華等[5]發(fā)現(xiàn)，微波法比水提醇沉法和超聲波法的提取率高，但工業(yè)生產(chǎn)上考慮綠色環(huán)保，不宜采用長時間、高強度的微波；李志洲[6]采用了泡沫分離法，但工藝中需要使用表面活性劑、消泡液等，增加了原料的消耗，且需要控制空氣流速，操作難度較大；杜敏華等[7]采用傳統(tǒng)的水提醇沉法，但并未全面考察各種因素對提取工藝的影響，多糖提取率較低。水提醇沉法為提取真菌多糖最經(jīng)典的方法，具有工藝簡單、成本低、易于推廣等特點。為此，本研究使用了水提醇沉法，并采用正交試驗法優(yōu)化了牛肝菌多糖的提取工藝，以期為進一步地開發(fā)利用牛肝菌提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

牛肝菌，購于承德潤隆食品有限公司（批號20120906003）。所用試劑均為分析純。電熱恒溫水浴鍋（WSZ-133-65，上海東星建材實驗設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵（石家莊陽星儀器貿(mào)易有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 牛肝菌多糖的提取流程[8]稱量牛肝菌粉末15.0g，加300ml石油醚于70℃水浴鍋中脫脂1.5h后抽濾。脫脂后的牛肝菌以不同的料水比于100℃水浴鍋中加熱不同時間，4000r/min離心10min。取沉淀重復(fù)加水、加熱、離心三個步驟，進行不同的次數(shù)。多次所得的上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮比為5：1，向濃縮液中加入無水乙醇至不同的乙醇濃度。低溫靜置過夜后4000r/min離心10min，將上層酒精萃取液再次用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮、醇沉，4000r/min離心10min。收集兩次所得沉淀，即得牛肝菌多糖。牛肝菌多糖-40℃低溫冷凍48h干燥，稱量凍干膏，并計算多糖提取率。多糖提取率=（凍干膏質(zhì)量/牛肝菌粉末質(zhì)量）×100%。

2.2 牛肝菌多糖提取的單因素實驗 選用料水比、提取時間、提取次數(shù)和醇沉濃度4個因素進行單因素實驗，考察各因素變量對牛肝菌多糖提取率的影響，選出適宜的條件范圍。

2.2.1 料水比：多糖提取率隨料水比的增加逐漸增加，考慮濃縮過程的成本，初步確定料水比為1：20～1：30(g/ml)。見圖1：

圖1 料水比對多糖提取率的影響

2.2.2 提取時間：多糖提取率隨提取時間的延長而增加，但提取時間過長會增加能源消耗，故初步確定提取時間為1.0～2.0h。見圖2：

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

2.2.3 提取次數(shù)：隨著提取次數(shù)的增加，多糖提取率逐漸上升。提取4次時最高峰值最高，因此確定提取2～4次進行正交實驗。見圖3：

圖3 提取次數(shù)對多糖提取率的影響

2.2.4 醇沉濃度：多糖提取率隨乙醇濃度的增大而增加，但乙醇濃度為85%時提取率下降，因此確定乙醇濃度為70%～80%。見圖4：

圖4 乙醇濃度對多糖提取率的影響

2.3 牛肝菌多糖提取的正交試驗設(shè)計 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以多糖提取率和多糖含量為考察指標，對料水比、提取時間、提取次數(shù)和醇沉濃度4個因素進行L9(34）正交優(yōu)化。因素水平見表1：

表1 正交試驗因素水平表

2.4 牛肝菌多糖含量的測定 稱量凍干膏并加水溶解，結(jié)合葡萄糖標準曲線計算凍干膏中牛肝菌多糖含量。葡萄糖標準曲線的制作采用苯酚-硫酸法[9]。多糖含量=（多糖質(zhì)量/凍干膏質(zhì)量）×100%。

正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。影響多糖提取效果的因素順序為提取時間＞乙醇濃度＞料水比＞提取次數(shù)，其中提取時間對多糖提取效果的影響最顯著。確定最佳提取工藝為：A1B1C2D3，即料水比為1：20(g/ml)，提取2次，每次1.5h，乙醇濃度為80%。

表2 牛肝菌多糖提取正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

2.5 最佳提取工藝驗證 稱取牛肝菌粉末15.0g，共3份，分別按照最佳提取工藝進行平行驗證試驗。牛肝菌中多糖平均提取率為29.56%，干膏中多糖的平均含量為53.83%，菌體中多糖的平均含量為15.91%。表明本文中的最佳提取工藝合理，穩(wěn)定可行，能有效提取牛肝菌中的多糖。結(jié)果見表4：

表4 優(yōu)選工藝的驗證試驗

3 討論

本研究在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，提取時間和次數(shù)達到最大時多糖已提取完全，繼續(xù)提取只會增加干膏中多糖以外其它成分的含量，因此隨著提取時間的延長和提取次數(shù)的增加，干膏中多糖含量與多糖提取率并不成正比。本研究通過正交試驗，以多糖提取率和干膏中多糖含量為評價指標，篩選出了牛肝菌多糖的最佳提取工藝，即料水比1：20(g/ml)、提取2次、每次1.5h、醇沉時乙醇濃度為80%。此時牛肝菌多糖提取率為29.56%，干膏中多糖含量高達53.83%，菌體中多糖含量為15.91%。

【參考文獻】

[1]Jia J, Zhang X, Hu YS, et al. Evaluation of in vivo antioxidant activities of Ganoderma lucidum polysaccharides in STZ-diabetic rats [J]. Food chemistry, 2009, 115(1): 32-36.

[2]Meng F, Liu X, Jia L. Optimization for the production of exopolysaccharides from Morchella esculenta SO-02 in submerged culture and its antioxidant activities in vitro [J].Carbohydrate Polymers, 2010, 79(3):700-704.

[3]盛偉，方曉陽，吳萍.白靈菇、杏鮑菇、阿魏菇多糖體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2008，29(5)：103-106.

[4]崔福順，張華，李官浩，等.美味牛肝菌黃酮類提取物體內(nèi)抗氧化作用研究[J].食品科技，2014，39(8)：201-205.

[5]王浩華，謝美華，宋信信.云南野生粗網(wǎng)柄牛肝菌粗多糖提取工藝及抗氧化能力的研究[J].楚雄師范學院學報，2015，30(9)：44-47.

[6]李志洲.泡沫分離法優(yōu)化美味牛肝菌多糖分離工藝[J].食品與機械，2012，28(3)：130-134.

[7]杜敏華，張英君，劉明星，等.野生牛肝菌多糖提取工藝的優(yōu)化及其對自由基的清除作用[J].食品工業(yè)科技，2012，33(22)：292-295.

[8]熊偉，陳芝蘭，鐘國輝，等.西藏野生變色疣柄牛肝菌粗多糖提取及單糖組成研究[J].應(yīng)用化工，2007，36(6)：554-556.

[9]涂宗財，李敏，劉光憲，等.苯酚-硫酸法測定油菜花粉多糖含量的研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28(4)：219-221.