鴿糞中酵母菌分離與鑒定

馬玉英 安堯汶 何嚴峰

（1，新疆石河子工程技術學校 832000；2，新疆霍城縣三宮鄉畜牧獸醫站 835200；3，新疆塔城市畜牧獸醫站 830049）

酵母菌細胞一般成圓形、卵圓形、圓柱形或檸檬形，每種酵母細胞有其一定的形態大小。大多數酵母菌在平板培養基上形成的菌落較大而厚，濕潤、較光滑，顏色較單調 （多為乳白色，少有紅色，偶有黑色）。紅酵母屬細胞圓形、卵形或長形，多邊芽殖，少數形成假菌絲。無發酵能力，但能同化某些糖類，常污染食品，少數為致病菌。代表種為黏紅酵母。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

采自石河子南山石場鎮和農八師132團場私人養殖鴿子的新鮮鴿糞，共收集6份樣品，石河子南山石場鎮和農八師132團各3份，上述樣品采集放入無菌三角瓶后，置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培養基

沙堡氏培養基，咖啡酸培養基，尿素酶瓊脂斜面，無碳源基礎培養基。

1.1.3 主要試劑

0.4﹪的酚紅溶液，20﹪尿素溶液，Tween-80溶液，1.6%溴甲酚酒精溶液，山羊血清。

1.1.4 主要儀器

光學顯微鏡，電子天平，超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化

（1）將采集的標本每份取1.0g左右放入高壓過的小瓶中，加入10ml無菌生理鹽水，充分震蕩混勻后，靜置15min使之，吸取0.5ml上清液接種于沙堡氏培養基 （加有氯霉素）和咖啡酸培養基 （加有氯霉素）置于37℃溫箱中培養3d，挑取疑似酵母菌的菌落，革蘭氏染色后鏡檢，確認為真菌后接種到沙堡氏培養基 （加有氯霉素），純化2～3次接種到沙堡氏斜面 （加有氯霉素）培養3d，置于4℃冰箱中保存備用。

（2）將采集的標本每份取1.0g左右放入高壓過的三角瓶中，加入20ml普通肉湯 （加有氯霉素）后置于37℃溫箱中培養3d，革藍氏染色后做顯微鏡檢查，確認為真菌后接種到沙堡氏培養基 （加有氯霉素），純化2～3次接種到沙堡氏斜面 （加有氯霉素）培養3d，置于4℃冰箱中保存備用。

1.2.2 酵母菌的鑒定

1.2.2.1 酵母菌形態學的鑒定

（1）菌落特征的觀察

將被檢菌在沙堡氏培養基 （加有氯霉素）上37℃培養1～3d，選擇單個典型菌落起顏色、形狀、透明度、光滑度、濕潤度和邊緣整齊情況等特征。

（2）細胞形態的觀察

將被檢菌在沙堡氏培養基 （加有氯霉素）上37℃培養1～3d，逐日選擇單個典型菌落進行革蘭氏染色后顯微鏡檢查，連續7d。

（3）微培養的觀察

有小培養法將被檢菌接種到玻片上，逐日在顯微鏡下觀察被檢菌的生長、菌絲、孢子情況。

1.2.2.2 酵母菌特性培養的鑒定

（1）最適生長溫度的試驗

將接種好的沙堡氏斜面 （加有氯霉素）分別放入不同溫度的條件下培養，觀察其生長過程有何不同。

（2）尿素酶試驗

將被檢菌生長旺盛時接種到尿素酶斜面上，放入37℃溫箱中培養1～7d，逐日觀察尿素酶斜面有無顏色變化，若斜面由淡紅色變為紫紅色為陽性，不變色則為陰性。

（3）咖啡酸試驗

將被檢菌生長旺盛時接種到咖啡酸培養基上，放入37℃溫箱中培養1～7d，逐日觀察咖啡酸培養基有無顏色變化，若培養基變為棕褐色為陽性，不變色則為陰性。

1.2.2.3 酵母菌的生化鑒定

（1）發酵試驗

將被檢菌生長旺盛的時候分別接種到蔗糖、麥芽糖、乳糖與葡萄糖培養基中，放入37℃溫箱中培養1～7d，逐日觀察糖培養基有無顏色變化和氣泡產生，培養基不變色，不產生氣泡為陰性，有顏色變化，產生氣泡或兩種情況同時存在則為陽性。

（2）同化試驗

先制作無碳源基礎培養基，將被檢菌混入無碳源基礎培養基中傾倒平板。凝固后貼附含糖 （15﹪的糖水）濾紙片。陽性在紙片周圍有一圈明顯的生長圈，無生長圈則為陰性。

1.2.3 動物試驗

將培養好被檢菌懸液 （9億菌），用無菌針管各吸取1ml分別注入6只健康的小白鼠腹腔內并做一陰性對照，在隨后的一個月內觀察小白鼠變化。

2 結果與分析

2.1 鴿糞中酵母菌的分離

通過培養、純化與鏡檢，6份樣品均分離出疑似酵母菌。

2.2 菌落形態和細胞形態

從6份鴿糞樣品中分離的酵母菌，觀察菌落形態 (酵母型菌落)、細胞形態及小培養觀察結果見表1、表2。

2.3 特性培養鑒定與生化鑒定

通過試驗發現，被檢菌在25～28℃為最適生長溫度，在該溫度范圍內，被檢菌生長最快。其他培養特性鑒定和生化鑒定結果見表3。因6份樣品中分離出來的疑似酵母菌在培養特性鑒定與生化鑒定結果相同，故不作單個介紹。

2.4 動物試驗

從小白鼠人工感染被檢菌以后，通過近兩個月的連續觀察，除一只小白鼠意外死亡外，其余6只小白鼠一直保持健康狀態，無任何疾病癥狀，從而說明該酵母菌無致病性。

3 討論

3.1 酵母菌的分離純化

菌種分離提純應盡可能做到全面、細致、不丟、不重，在試驗過程中對樣品進行2～3次分離。分離培養的溫度為37℃，雖然適合大多數酵母菌生長，但通過這次試驗獲知大多數酵母菌的最適生長溫度在25～30℃左右，沙堡氏培養基上生長良好。

3.2 酵母菌屬的鑒定

表1 菌落形態

表2 細胞形態和小培養鑒定結果

表3 培養特性鑒定與生化鑒定結果

根據 《酵母菌特性及鑒定手冊》和 《醫學微生物學實驗技術》等介紹的方法，酵母菌的鑒定主要以形態學特征為主并結合生理學特征。形態學特征包括菌落形態、細胞形態、假菌絲、子囊孢子等，生理學特征包括芽管試驗、葡萄糖發酵、同化試驗等。從實驗結果可以看出，酸鴿糞中的酵母菌形態相似，種類不多，從6份樣品中分離得到酵母菌經屬的鑒定為同一屬酵母菌：紅色酵母屬。