驅動蛋白Kif4A桿狀病毒表達系統的構建與優化

于東渤　張紅嬌　蘇春玉　余斯琦　朱長軍　董智雄

摘 要：目的 為了探究人驅動蛋白分子Kif4A在有絲分裂過程中的作用及其調節機制，需要在體外表達并純化有活性的Kif4A蛋白。方法 構建了驅動蛋白Kif4A的體外真核表達載體pFastBac-Kif4A，將其轉化到DH10Bac感受態細胞中，通過藍白斑篩選得到陽性克隆，抽提得到桿狀病毒基因組。由于桿狀病毒基因組較大，標準的轉染方法轉染效率較低，對該方法進行了優化。將桿狀病毒基因組通過標準的和優化的轉染方法轉染到草地夜蛾卵巢細胞SF9中，經培養得到表達驅動蛋白Kif4A的初代桿狀病毒。結果 通過檢測初代桿狀病毒的滴度， 我們發現，與標準的轉染方法相比，優化的轉染方法所得到的初代桿狀病毒的滴度更高，相同稀釋度感染條件下表達的Kif4A蛋白水平更高。結論 本研究成功構建了Kif4A桿狀病毒表達系統，并優化了SF9細胞轉染的方法，為后續大量表達和純化Kif4A蛋白奠定了基礎。

關鍵詞：驅動蛋白 Kif4A 桿狀病毒 脂質體轉染

中圖分類號：Q291 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2018）09（c）-0235-05

昆蟲桿狀病毒表達系統是一種以昆蟲桿狀病毒為外源基因表達載體，昆蟲細胞作為表達受體的外源基因真核表達系統[1]。與原核表達系統相比，昆蟲桿狀病毒表達系統具有安全性好、重組蛋白表達量高、重組蛋白翻譯后加工等特點，因而得到了廣泛的應用。這種表達系統除了可以大量高效的表達所需要的目的蛋白，同時在表達過程中可以進行翻譯后修飾，使目的蛋白的免疫原性、ATP酶活性等生物活性與天然蛋白基本相同[2]。因此，應用昆蟲桿狀病毒表達系統進行目的蛋白的表達，可以大量高效的得到與天然蛋白基本相同的蛋白質。

驅動蛋白分子（Kinesin）是細胞內以微管為軌道的通過水解ATP進行移動的馬達蛋白。此類蛋白分子是細胞內主要的運輸工具，不僅在細胞中起著運輸的功能，而且對細胞有絲分裂過程起極其重要的作用。Kif4A是kinesin-4家族成員，基因定位于人類染色體Xq13.1，cDNA長度為3699bp，編碼1232個氨基酸，蛋白相對分子量約140kDa。與其他驅動蛋白分子相同，Kif4A蛋白也由3個保守的功能域組成：N端球形的馬達結構域（motor domain）；中央卷曲螺旋桿狀結構域（stalk domain），和C端扇形的尾部（tail domain）。在細胞中Kif4A通過中間的桿狀螺旋區形成同源二聚體；通過C端的尾部結合相應的“貨物”；通過N 端球形結構域結合到微管上，向微管的正極末端移動。在有絲分裂過程中Kif4A功能的發揮依賴于有絲分裂過程中蛋白激酶的磷酸化調節。在有絲分裂早期，Kif4A主要受CDK1激酶磷酸化修飾，修飾發生在T1161位點，修飾后的Kif4A定位于染色體上，參與染色體的凝集和中板集合，在有絲分裂晚期，Kif4A主要受Aurora B激酶磷酸化修飾，修飾發生在T799和S801位點，修飾后的Kif4A集中在紡錘體中央區（spindle midzone）和中小體（midbody）上，協助姐妹染色單體的分離和紡錘體中央區（midzone）及中小體（midbody）的形成。磷酸化的修飾使Kif4A具備了不同的功能，進而調節有絲分裂的進程。但是Kif4A的不同磷酸化之間的關系仍不清楚，明確驅動蛋白Kif4A磷酸化調節的相互關系，有助于了解磷酸化修飾對Kif4A ATP酶活性調節的機制，同時更深入的闡明細胞有絲分裂過程。

為了研究Kif4A不同修飾的相互關系，我們需要體外表達并純化天然構象的Kif4A蛋白。我們擬構建Kif4A的體外真核表達載體pFastBac-Kif4A，轉化DH10Bac感受態，得到桿狀病毒基因組，通過轉染SF9昆蟲細胞得到桿狀病毒，并表達和純化Kif4A蛋白。由于桿狀病毒基因組較大，傳統的方法轉染效率較低，無法得到高滴度的桿狀病毒，本研究通過對轉染過程的優化，得到了滴度更高，蛋白表達水平更高的桿狀病毒，為體外轉染SF9細胞提供了新的方法，同時為進一步研究Kif4A在有絲分裂過程中的功能奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質粒和菌株

pFastBacHTb真核表達載體、pEGFPC1真核表達載體、pEGFP-kif4A真核表達載體為本實驗室自存；大腸桿菌感受態細胞Trans T1購自北京全式金生物技術有限公司、大腸桿菌感受態細胞DH10Bac購自上海唯地生物技術有限公司；草地夜蛾卵巢細胞SF9為本實驗室保存細胞株。

1.1.2 主要試劑與儀器

2×Taq Master Mix（南京諾唯贊生物技術有限公司）；限制性內切酶SalⅠ、BamHⅠ、BglⅡ以及Superfect轉染試劑（美國QIAGEN公司）；T4DNA連接酶、Super DNA Marker（北京康為世紀生物科技有限公司）；凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；特異性多克隆兔抗Kif4A抗體，實驗室自制；特異性單克隆鼠抗Flag抗體，美國Sigma公司；細胞培養及SIM SF（北京義翹神州科技有限公司）；其他化學試劑為進口或國產分析純。DNA序列測定和引物合成均由北京中美泰和生物技術有限公司完成。

Mycycler普通PCR儀（北京匯力宏業生物技術有限公司）、Nikon TS100倒置顯微鏡（日本Nikon公司）、BG-Power600通用電泳儀（北京百晶生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 pFastBac- Kif4A載體的構建

將連接到pEGFPC1質粒上的kif4A切下，連接到pFastBacHTb質粒上。pFastBacHTb質粒通過BamHⅠ和SalⅠ雙酶切；pEGFPC1-kif4A質粒通過SalⅠ和BglⅡ雙酶切；酶切產物經過凝膠回收試劑盒回收，按照適當的比例用T4 DNA連接酶室溫連接1h，將所得全部連接產物轉化Trans T1感受態細胞，涂布在LB-AMP+（含氨芐青霉素）抗性固體培養基過夜培養，篩選陽性克隆，利用質粒提取試劑盒提取質粒后進行雙酶切鑒定。將初步鑒定正確的質粒送北京中美泰和生物技術有限公司測序。

1.2.2 轉化DH10Bac感受態細胞

將所得到的正確的pFastBac- Kif4A質粒轉化到DH10Bac感受態細胞中，細胞復蘇4h后，涂布到含有Tet+、Kan+、Gen+（含四環素、卡那霉素、慶大霉素）3種抗性的LB固體培養基上。37℃避光培養48h。由于pFastBacHTb質粒在DH10Bac感受態細胞中會發生轉座，轉座的發生破壞了細胞中的Lac Z的基因，使細胞不能分解X-gal而形成白色的克隆。經過藍白斑篩選，挑取3個白色克隆，在新的固體培養基上劃線培養，37℃培養16～24h，進一步驗證白色克隆確實發生了轉座。

1.2.3 桿狀病毒基因組的提取及驗證

挑取經驗證發生轉座的克隆至含有Tet+、Kan+、Gen+（含四環素、卡那霉素、慶大霉素）三種抗性的LB液體培養基，37℃過夜培養，提取桿狀病毒基因組。將菌液轉移到1.5mL離心管中，14000g離心1min；吸棄上清，0.3mL溶液I[15mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10mmol/L EDTA，100μg/mL RNase A]重懸菌體，加0.3mL溶液II（0.2 mol/L NaOH， 1% SDS），顛倒混勻后室溫孵育5min；加入0.3mL 3mol/L醋酸鉀，顛倒混勻后冰上孵育5min；14000g室溫離心10min；將上清轉移到新的裝有0.8mL異丙醇的1.5mL離心管中，混合均勻后冰上孵育5min；14000g室溫離心15min；吸棄上清，加入0.5mL 70%的乙醇，14000g室溫離心5min；吸棄上清，室溫干燥5min，50μL超純水溶解沉淀DNA。用所得桿狀病毒基因組進行PCR驗證轉座的發生，引物序列：M13-Fwd 5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'；Kif4A-antisense 5' GCACTGATTACATTTCCC 3'。

1.2.4 SF9細胞培養與SF9細胞轉染

SF9細胞用SIM SF培養基，27℃下，120r/min懸浮培養。轉染前，將SF9細胞接種于6孔板，每孔2mL SIM SF培養基中接種1×106個細胞，27℃下細胞貼壁1h后進行桿狀病毒基因組轉染。1μg重組桿狀病毒DNA稀釋到150μL SIM SF培養基中，15μL Superfect轉染試劑稀釋到150μL SIM SF培養基中，將基因組與轉染試劑混合均勻后，室溫孵育20min。標準的轉染方法：20min后，去除舊的培養基，加入1.7mL新培養基，滴入轉染混合液，轉染5h后換液，去除轉染混合液，加入2mL含環丙沙星抗生素的SIM SF培養基，27℃培養4d。優化的轉染方法：20min后，去除舊的培養基，加入0.7mL新培養基，滴入轉染混合液，轉染5h后，加入1mL含兩倍環丙沙星抗生素的SIM SF培養基，27℃培養4d。4d后得到的細胞培養基，500g離心5min，收集桿狀病毒，4℃保存。

1.2.5 桿狀病毒滴度的鑒定

24孔板中接種5×104個細胞，細胞貼壁1h后，按照設置好的濃度梯度，1：1、1：10、1：50、1：200、1：500、1：1000分別加入桿狀病毒，細胞培養72h，收取細胞，100μL 1×的loading buffer（SDS質量分數為2%，甘油體積分數為10%，Tris-Cl濃度為50mmol/L，pH為6.8，β-巰基乙醇體積分數為1%，溴酚藍質量分數為0.004%）裂解，Western Blot檢測蛋白水平。

1.2.6 Western Blot 檢測蛋白表達

取20μL裂解液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒定電流為30mA，分離蛋白質1.5h后，半干轉印電泳槽轉移蛋白質至PVDF膜上，質量分數為50mg/mL的脫脂奶粉封閉30min后，以鼠抗Flag標簽為一抗室溫孵育2h，以偶聯了辣根過氧化物酶的羊抗鼠抗體為二抗室溫孵育1h，將增強化學發光劑（ECL）與H2O2混合后，與PVDF膜孵育3min，暗室內用X射線膠片進行顯影。

1.2.7 桿狀病毒的擴增

6cm平皿中接種3×106個細胞，細胞貼壁1h后，加入20μL的桿狀病毒，培養72h后，收取細胞培養液，500g離心5min，將上清轉移到新的離心管中，4℃保存。

2 結果

2.1 pFastBac- Kif4A載體的構建

將用SalⅠ和BglⅡ雙酶切的pEGFP-Kif4A質粒和用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切的pFastBacHTb質粒進行瓊脂糖凝膠電泳，如圖1（A）所示。之后通過割膠回收得到Kif4A和pFastBacHTb線性DNA，如圖1（B）所示。通過T4連接酶室溫連接1h，連接產物轉化Trans T1感受態，挑取陽性克隆，如圖1（C）。通過質粒提取試劑盒提取pFastBac-Kif4A質粒。質粒經過測序，與NCBI公布的序列比對，DNA序列信息相同，證明pFastBac- Kif4A質粒構建成功。

2.2 pFastBac-Kif4A質粒在DH10Bac感受態細胞中的轉座與驗證

將構建好的pFastBac-Kif4A質粒轉化至DH10Bac感受態細胞中，48h后觀察培養基上藍白斑克隆的狀況，挑取3個待鑒定的白色克隆劃線到新的培養基上，24h后觀察菌落顏色，如圖2（A）所示，經鑒定菌落顏色確實為白色。挑取白色克隆，過夜培養，提取桿狀病毒基因組，通過PCR的方法驗證轉座的發生，如圖2（B）所示，PCR產物電泳圖可以看到明顯的條帶，且大小與理論值相符，證明轉座成功。

2.3 桿狀病毒基因組轉染SF9細胞

應用標準的和優化的轉染方法進行SF9細胞轉染，顯微鏡下對細胞進行觀察。可以發現，對照組細胞是未經過任何處理的，細胞形態和大小正常，大多數細胞貼壁；標準的轉染方法中，只有小部分細胞變圓、變大，并且貼壁不牢（圖3黑框所示）；而優化的轉染方法中，大部分細胞變圓、變大，貼壁效果明顯降低，如圖3所示。