microRNA-34a對食管鱗癌細胞增殖、凋亡的影響

李 梅，朱建波，2，姬 玉，吳 菲，楊 蘭，李 鋒，3

(1.石河子大學，新疆 石河子 832000； 2.第三軍醫大學附屬第二醫院腫瘤科，重慶 400037；3.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院病理科，北京 100043)

微RNA(microRNA，miR)是一類小的、高度保守的非編碼RNAs，通過誘導靶miR的降解或抑制miR的轉錄后翻譯過程，調控著人類超過30%的基因的表達。目前，大量研究證實miR在細胞生長、增殖、凋亡及侵襲、遷移過程中發揮著重要作用[1-3]，且越來越多的文獻顯示miR也參與了多種腫瘤的發生、發展。目前，miR-34a在腫瘤中研究較多，報道顯示其在肝癌[4]、肺癌、結腸癌[5]中均發揮著抑癌作用，隨著研究的進展，對miR-34a與食管癌的關系也有了進一步認識。食管鱗癌(ESCC)中miR-34a低表達，且與食管鱗癌的分化程度、淋巴結轉移及臨床分期具有相關性；高表達miR-34a能夠抑制其侵襲遷移[6-7]。以上研究表明miR-34a在食管癌中可能發揮著抑癌基因的作用，那么其對食管癌增殖、凋亡的生物學行為有何影響？本研究以食管鱗癌細胞Eca109為研究對象，檢測了ESCC細胞中miR-34a的表達，分析miR-34a對食管癌增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 Eca109， DMEM液體培養基，miR-34a模擬物/抑制劑，miR-34a模擬物/抑制劑陰性對照，HiperFect轉染試劑，miR提取試劑盒，miScript Reverse Transcription Kit，Primer，miScript SYBR Green PCR Kit，MMT試劑，Annexin V/PI凋亡試劑盒，鼠抗人Bcl-2，鼠抗人Bax。

1.2 細胞培養和轉染 Eca109用DMEM完全培養基培養，條件為5%CO2，37 ℃。實驗分組：轉染miR-34a模擬物(mimic)組，轉染miR-34a抑制劑(inhibitor)組，轉染miR-34a模擬物/抑制劑陰性對照(miR-34a NC/ miR-34a In-NC)及空白對照組。接種細胞后用無血清培養液稀釋miR-34a模擬物、miR-34a抑制劑及miR-34a模擬物/抑制劑陰性對照，并分別加入適量Hiperfect轉染試劑輕輕搖勻，室溫靜置5～10 min。滴加入轉染復合物于細胞中，將轉染好的細胞在CO2培養箱中孵育。

1.3 實時熒光定量PCR檢測miR-34a表達 參照miRNA提取說明書提取總RNA，根據miScript Reverse Transcription Kit步驟進行反轉錄，按照miScript SYBR Green PCR Kit步驟進行加樣并用7500fast Real-time PCR儀器進行miR-34a擴增。以上操作嚴格遵照說明書步驟，以U6為內參，每個樣本同時做3個復孔，記錄Ct值，用2-△△Ct方法分析數據。

1.4 MMT檢測細胞增殖 轉染后的細胞分別培養24 h、48 h、72 h、96 h，棄培養基，避光條件下每孔加入提前配制好的MTT溶液140 μL，然后37 ℃恒溫培養4 h后棄上清液，向每孔加中20 μL DMSO，用錫箔紙包好搖勻，于酶標儀上測定其490 nm處吸光度(OD值)，并記錄實驗結果。以培養時間24 h、48 h、72 h、96 h為橫坐標，復孔的平均OD值為縱坐標，繪制生長曲線，分別計算過表達組和抑制組與其相應對照組細胞的增殖能力變化。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 轉染后的細胞于恒溫培養箱中培養48 h，重懸細胞。每管加入10 μL熒光標記 Annexin V試劑和5 μL PI試劑；室溫孵育10 min。吸取200 μL的細胞至裝有2 mL 1PBS的流式測定管中。上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，每組細胞重復檢測3次。

1.6 Western blot檢測增殖凋亡相關蛋白表達 轉染后的細胞分別提取總蛋白，取等量蛋白于SDS-PAGE凝膠上電泳，然后轉膜，敷一抗(bcl-2 1∶1000，bax 1∶1000濃度)4 ℃過夜，1×TBST洗膜3次，每次5 min，然后敷二抗2 h，1×TBST洗膜3次，最后用ECL化學發光試劑檢測bcl-2、bax蛋白表達，以β-actin為內參。

1.7 統計學分析 所有數據采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 轉染 miR-34a 模擬物/抑制物后食管癌Eca109細胞中miR-34a的表達 實時熒光定量PCR檢測轉染miR-34a模擬物/抑制劑后食管癌Eca109細胞中miR-34a的表達結果顯示：過表達組miR-34a表達水平明顯高于陰性對照(NC)組(P<0.01)，抑制劑組miR-34a的表達水平較NC組降低(P<0.05)。

2.2 轉染 miR-34a 模擬物/抑制物后對食管癌Eca109細胞增殖能力的影響 MTT法檢測轉染miR-34a 模擬物、miR-34a 抑制劑及陰性對照24 h、48 h、72 h、96 h后對Eca109細胞增殖的影響，見圖1、圖2。

圖1 MTT法檢測轉染miR-34a mimc和NC后Eca109的增殖能力變化

圖2 MTT法檢測轉染miR-34a inhibitor和NC后Eca109的增殖能力變化

由圖1可見，與轉染NC組相比，轉染miR-34a 模擬物組細胞的吸光度明顯下降(P<0.05)；由圖2可見，Eca109細胞轉染miR-34a抑制劑后其細胞的存活率高于NC組(P<0.05)。實驗結果表明：體外實驗中，過表達miR-34a對食管癌細胞的增殖有抑制作用，而低表達miR-34a可以促進食管癌細胞的增殖。

2.3 轉染 miR-34a 模擬物/抑制物后對食管癌Eca109細胞凋亡能力的影響 各組細胞經Annexin V/PI雙染處理后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率，與NC組相比，轉染miR-34a 模擬物細胞組的凋亡率顯著增加(P<0.05)(見圖3)，而轉染 miR-34a抑制劑細胞組的凋亡率較NC組明顯降低(見圖4)。上述結果提示過表達miR-34a能夠促進食管癌細胞的凋亡，抑制miR-34a表達能夠降低食管癌細胞的凋亡。

圖3 流式細胞儀檢測轉染miR-34a mimic和NC后Eca109細胞的凋亡變化

圖4 流式細胞儀檢測轉染miR-34a Inhibitor和NC后Eca109細胞的凋亡變化

2.4 轉染 miR-34a 模擬物/抑制物后對食管癌Eca109細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的影響 Western blot結果顯示，miR-34a模擬物轉染的Eca109細胞中抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表達顯著下降，而促凋亡基因Bax的蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)；相反，轉染miR-34a 抑制劑細胞組的Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達下降(P<0.05)

3 討 論

miR-34a是miR-34家族(miR-34a/b/c)的一員，定位于1p36.22，其普遍表達于多種腫瘤中，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌和膀胱癌等[8]。Yamakuchi等[9]研究表明結腸癌細胞系HCT116中miR-34a能夠通過抑制SIRT1增加p53乙酰化和P21 puma的表達，進而促進結腸癌細胞凋亡；膀胱癌中，miR-34a 通過靶向CD44抑制膀胱癌細胞的侵襲、遷移及血管生成[10]。這些研究都表明miR-34a以抑癌基因的作用參與多種腫瘤的進展。Nie等[7]的研究表明miR-34a在食管癌中表達下調，其能夠通過靶向作用于YinYang-1抑制食管鱗癌的轉移和侵襲。

本實驗中，我們用食管鱗癌細胞Eca109為研究對象，首先用實時熒光定量PCR檢測轉染miR-34a模擬物/抑制劑后食管鱗癌細胞Eca109中miR-34a的表達，發現轉染miR-34a模擬物，miR-34a表達升高；轉染miR-34a抑制劑，miR-34a表達降低，且無論是過表達組或抑制劑組miR-34a和U6的溶解曲線均呈單峰表現，說明引物特異性良好，實驗過程中未出現非特異性擴增。這充分說明本實驗中細胞處理成功，為后續實驗打下了良好基礎。隨后我們用MTT法和流式細胞儀檢測了轉染miR-34a模擬物/抑制劑對Eca109細胞增殖凋亡的影響，發現miR-34a過表達能夠抑制食管癌細胞的增殖，促進食管癌細胞的凋亡，而抑制miR-34a的表達則促進食管癌細胞的增殖，抑制食管癌細胞的凋亡。為了進一步驗證miR-34a對食管癌細胞增殖凋亡的影響，我們用Western blot檢測了轉染miR-34a 模擬物/抑制劑后Eca109中增殖凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達，發現miR-34a能抑制抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表達，而促進促凋亡基因 Bax的蛋白表達。Nie等[7]曾在食管鱗癌細胞系TE-1中轉染miR-34a模擬物/抑制劑及其相對應的陰性對照，發現miR-34a促進了食管癌細胞的凋亡。本實驗與此研究Eca109中結果相一致。

綜上所述，miR-34a在食管癌中發揮著抑癌基因的作用，但其發揮作用的分子機理尚未完全明了，進一步研究miR-34a影響食管癌增殖凋亡的分子機理將會對食管癌的治療提供強有力的理論基礎。

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